Chirale Membranen II

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Herstellung von Kanalproteinmembranen

In der Natur werden Ionen und chirale Verbindungen selektiv über Kanalproteine durch biologische Membranen transportiert. Chirale Verbindungen sind Moleküle, welche über die gleiche Größe, Form und Ladung verfügen und sich nur strukturell in der Orientierung von mindestens einem Molekülrest unterscheiden.

In dem BMBF-geförderten Projekt – Chirale Membranen, November 2012 – Januar 2018, der Initiative Nächste Generation biotechnologischer Verfahren, Biotechnologie 2020+ – wurden vom Tandem-Team bestehend aus unserer Gruppe, als Projektkoordinator und der Gruppe von Prof. Dr. Alexander Böker – Fraunhofer IAP Potsdam – grundlegende Ergebnisse zur Generierung von Protein-Polymer-Membranen erarbeitet.

Ziel des Tandemprojektes war es, Membranen aus Proteinbausteinen zu synthetisieren, um eine chirale Trennung von Enantiomer-Gemischen zu erzielen. Damit sollten neuartige biotechnologische Verfahren in der Stofftrennung und Stoffaufarbeitung ermöglicht werden.

 
 

Vorarbeiten im Rahmen des Projektes Chirale Membranen I bereiten den Weg

Als biologische Komponente wurden in zwei parallelen Strategien Varianten des Eisentransporters ferric hydroxamate uptake protein component A, FhuA, hergestellt. FhuA ist ein Transmembranprotein in einer β‑Fassstruktur, aus der äußeren Membran von Escherichia coli. Der Unterschied in beiden Strategien ist die Verwendung des FhuA-Kanalproteins mit entweder einem geschlossenen Kanal oder einem offenen Kanal. In beiden Strategien wurde das Ziel verfolgt, das Innere des Kanals so zu gestalten, dass eine chirale Trennung von zwei Enantiomeren ermöglicht wurde. Ein weiteres Ziel des Tandemprojektes ist das Engineering der äußeren Oberfläche des FhuA-Kanals, um eine effiziente Konjugation von Polymerketten zu ermöglichen.

Ausgehend von Lysinresten, die explizit in einer Ebene an der äußeren FhuA-Kanaloberfläche oberhalb der hydrophoben Transmembranregion des Proteins angeordnet sind, sollten die Polymerketten, vom FhuA-Proteinkanal startend, wachsen. Die hergestellten FhuA-Polymer-Konjugate dienten anschließend zur Synthese von FhuA-Polymer-Membranen. Nach Kombination beider Ansätze des Protein-Engineeringg, innen und außen, wurde die Fähigkeit zur Trennung von enantiomeren Gemischen der generierten FhuA-Polymer-Membranen bestimmt.

Die Projektziele der ersten Phase wurden in hohem Maße erreicht. Es gelang Kanalproteinmembranen mit definierten monodispersen Poren herzustellen, diese zu charakterisieren und die Präferenz des Kanalproteins für Enantiomere mittels Proteinengineering zu verändern. In der Schwaneberg AG wird nun weiter an der Mission geforscht, Membranen zu genieren, die chirale Moleküle trennen können.

Vom Proof of Concept zur Kanalproteinmembranen: Projekt Chirale Membranen II

Basierend auf den Ergebnissen der ersten Förderphase zum Kanalprotein FhuA und dem Proof of Concept, ist das Ziel des Anschlussvorhabens – Chirale Membranen II, Start im Februar 2018 – eine Produktionstechnologie für großflächige Kanalproteinmembranen zusammen mit unserem Tandem-Team AG Böker, zu entwickeln. Langfristiges Ziel ist die Entwicklung des biotechnologischen Trennverfahrens.

 
  Flußschema des Projectes Chirale Membranen 2 Urheberrecht: © Bio VI
 
 

Um die erforderlichen Strukturinformationen zu erhalten wird das Projekt in der zweiten Förderphase durch die Expertisen von der AG Groth von der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf und der AG Fitter – RWTH Aachen – ergänzt. Die AG Groth untersucht mittels Röntgenkristallographie die Struktur der Kanalprotein-Varianten. Die Expertise der AG Fitter liegt in der Fluoreszenzspektroskopie, welche mittels zeitaufgelösten Fluoreszenz-Anisotropiemessungen die Dynamik von angebundenen Fluoreszenzmolekülen untersuchen. Die Herausforderung zum Design von chiralen Membranfiltern mittels Proteinengineering ist groß, komplex und wissenschaftliches Neuland.

Die Ziele des Projekts können nur durch die Kombination interdisziplinärer Expertisen erreicht werden. Die Hauptherausforderung liegt in der Etablierung von Verfahren zur Aufreinigung sowie zur funktionellen Rückfaltung von FhuA-Varianten im Gramm-Maßstab für die Tandempartner.

 
 

Patentanmeldungen und Publikationen aus der ersten Förderphase

Patentanmeldungen

Einreichung einer gemeinsamen EU- und PCT-Patentanmeldung mit Tandempartner AG Böker zum - Poröse Dünnschichtmembran, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie Verwendungsmöglichkeiten-

EP16160714.8 mit Anmeldedatum 16.03.2016,

PCT/EP2017/054764 mit Anmeldedatum 01.03.2017.

Publikationen

M. L. Tebaldi, H. Charan, L. Mavliutova, A. Böker, U. Glebe, Dual-Stimuli Sensitive Hybrid Materials: Ferritin-PDMAEMA by Grafting-From Polymerization, Macromol. Chem. Phys., 2017, 218, 1600529.

J. Kinzel‡, D. F. Sauer‡, M. Bocola, M. Arlt, T. Mirzaei Garakani, A. Thiel, K. Beckerele, T. Polen, J. Okuda, U. Schwaneberg, 2-Methyl-2,4-pentanediol (MPD) boosts as detergent-substitute performance of ß-barrel hybrid catalyst for phenylacetylene polymerization, Beilstein J. Org. Chem, 2017, 13, 1498-1506.

H. Charan‡, U. Glebe‡, D. Anand, J. Kinzel, L. Zhu, M. Bocola, T. Mirzaei Garakani, U. Schwaneberg, A. Böker, Nano-thin walled micro-compartments from transmembrane protein–polymer conjugates, Soft Matter, 2017, 13, 2866-2875.

H. Charan‡, J. Kinzel‡, U. Glebe, D. Anand, T. Mirzaei Garakani, L. Zhu, M. Bocola, U. Schwaneberg, A. Böker, Grafting PNIPAAm from ß-barrel shaped transmembrane nanopores, Biomaterials, 2016, 107, 115-123.

L. Wu, U. Glebe, A. Böker, Surface-initiated controlled radical polymerizations from silica nanoparticles, gold nanocrystals, and bionanoparticles, Polym. Chem., 2015, 6, 5143-5184.

L. Zhu, M. Arlt, H. Liu, M. Bocola, D. F. Sauer, S. Goltzen, J. Okuda, U. Schwaneberg, in Bio-Synthetic Hybrid Materials and Bionanoparticles: A Biological Chemical Approach Towards Material Science, Channel Protein FhuA as a Promising Biomolecular Scaffold for Bioconjugates, RSC Smart Materials No. 16, 2015, 57-72.

U. Glebe, B. Santos de Miranda, P. van Rijn, A. Böker, in Bio-Synthetic Hybrid Materials and Bionanoparticles: A Biological Chemical Approach Towards Material Science, Synthetic Modifications of Proteins, RSC Smart Materials No. 16, 2015, 1-29.