Can constraint network analysis guide the identification phase of KnowVolution? A case study on improved thermostability of an endo-β-glucanase

19/02/2021
  Francisca Contreras and Christina Nutschel Copyright: © BIO VI Francisca (l.) and Christina (r.)

Can constraint network analysis guide the identification phase of KnowVolution? A case study on improved thermostability of an endo- β -glucanase

Contreras, F.*, Nutschel, C.*, Beust, L., Davari, M. D., Gohlke, H., & Schwaneberg, U., Computational and Structural Biotechnology Journal, 2021, Volume 19, 743-751. DOI 10.1016/j.csbj.2020.12.034
*These authors contributed equally to the work.

Die „Constraint Network Analysis (CNA)“ ist eine vielversprechende Methode zur Identifizierung von vorteilhaften Positionen in Phase I einer KnowVolution-Kampagne zur Verbesserung der Thermostabilität.

Projekt und Förderung: Maßgeschneiderte Enzymcocktails für den effizienten Celluloseabbau (EnzyBioDeg), BMBF, FKZ: 031B0506

Dazugehörige Veröffentlichung: KnowVolution of a GH5 cellulase from Penicillium verruculosum to improve thermal stability for biomass degradation

Abteilung: Computational Biology

Das Protein-Engineering hat sich als ein wichtiges Werkzeug zur Verbesserung der Thermostabilität von Enzymen herausgestellt. Da gerichtete Evolutionskampagnen noch immer mit hohen Zeit- und Arbeitsaufwand verbunden sind, stellt die effiziente Entwicklung von robusten Biokatalysatoren heutzutage noch eine große Herausforderung dar. Kombinierte Strategien aus gerichteter Evolution und computergestützten Analysen stellen daher einen effizienteren Ansatz für das Protein-Engineering dar. Die KnowVolution-Protein-Engineering-Strategie kombiniert gerichtete Evolution und computergestützte Analysen, um den experimentellen Aufwand zu verringern und die Verbesserungen der Enzymvarianten zu maximieren. In "Phase I: Identifizierung" wird die Zufallsmutagenese verwendet, um vorteilhafte Positionen in einem Enzym zu identifizieren. Eine kombinierte Strategie aus einer in silico Positionsauswahl, gefolgt von einer Durchmusterung einer Variantenbibliothek, kann den gesamten experimentellen Aufwand für die Verbesserung eines Biokatalysators reduzieren.

In dieser Studie untersuchen wir die „Constraint Network Analysis“ (CNA)-Strategie als computergestützte Methode, um vorteilhafte Positionen für eine verbesserte Thermostabilität der industriell wichtigen Endo-β-Glucanase Cel5A aus Penicillium verruculosum zu identifizieren. Zusätzlich haben wir das Potenzial von CNA in Protein-Engineering-Kampagnen (z. B. in der Identifikationsphase von KnowVolution) evaluiert. Mit der CNA-Methode kann der Screening-Aufwand um 40 % verringert werden. Eine zufallsmutagenisierte Bibliothek erforderte das Screening von ~8000 Klonen, wobei nur 0,27 % der Klone eine erhöhte Thermostabilität aufwiesen. Die CNA-geführte Bibliothek bestand aus 3840 Klonen und besaß eine vergleichbare Erfolgsrate von 0,18 %. Die Abdeckung der identifizierten Positionen, die die Thermostabilität verbessern, betrug 8 % für die CNA-Methode und 5,7 % für die Zufallsmutagenese. Wir glauben, dass die CNA-Methode in der Identifikationsphase einer KnowVolution-Kampagne eingesetzt werden kann, um die Thermostabilität von Cellulasen und anderen Enzymen mit geringerem Zeit- und Arbeitsaufwand zu verbessern.

  Utilization of Constraint Network Analysis or random mutagenesis in the identification Phase of a KnowVolution engineering campaign. Copyright: Computational and Structural Biotechnology. Copyright: © Computational and Structural Biotechnology Journal Figure. Utilization of Constraint Network Analysis or random mutagenesis in the identification Phase of a KnowVolution engineering campaign. Copyright: Computational and Structural Biotechnology.