Verbesserung der Robustheit von Sortase A durch Loop-Engineering und Backbone-Zyklisierung

10.08.2020
  Dr. Zhi Zou Urheberrecht: © BioVI Dr. Zhi Zou

Zhi Zou, Diana M. Mate, Maximilian Nöth, Felix Jakob, and Ulrich Schwaneberg*, Chem. - Eur. J., 2020, doi: 10.1002/chem.202002740

Loop-Engineering und Backbone-Zyklisierung von Sortase A verbessern die thermische Stabilität und die Beständigkeit gegen Denaturierungsmittel.

  Das Engineering des β7/ β7 Loops und Backbone-Zyklisierung von Sa-SrtA erhöhen die Robustheit von Sa-SrtA gegenüber erhöhten Temperaturen und Denaturierungsmitteln (z.B. Harnstoff und Guanidinhydrochlorid). Urheberrecht: © Wiley VCH Das Engineering des β7/ β7 Loops und Backbone-Zyklisierung von Sa-SrtA erhöhen die Robustheit von Sa-SrtA gegenüber erhöhten Temperaturen und Denaturierungsmitteln (z.B. Harnstoff und Guanidinhydrochlorid).

Sortase A aus Staphylococcus aureus (SaSrtA) wird aufgrund ihrer hohen Selektivität und Vielseitigkeit für spezifische Proteinmodifikationen verwendet. Sie verfügt jedoch nicht über die nötige Robustheit oder Widerstandsfähigkeit, um Biokonjugationsreaktionen bei erhöhten Temperaturen oder in Gegenwart von Denaturierungsmitteln (z.B. Harnstoff und Guanidinhydrochlorid) durchzuführen. Loop-Engineering und Head-to-Tail Backbone-Zyklisierung von SaSrtA wurden durchgeführt, um die thermische Robustheit und Stabilität gegen denaturierende Agenzien zu verbessern. Die Aktivität von Sa-SrtA wurde durch einen Cytochrome P450 BM3 (CYP102A1) Monooxygenase Rekonstitutions Assay bestimmt. Dabei wurden die Häm- und Reduktasedomänen von P450 BM3 getrennt, was zur Inaktivierung von P450 BM3 führte. Sa-SrtA ermöglichte die Religation der Domänen und damit die Wiederherstellung der Aktivität von P450 BM3. Das Loop-Engineering und die Backbone-Zyklisierung ergaben die zyklisierte Variante CyM6 (rM4-R159N/K162P), die eine um 7,5°C erhöhte Schmelztemperatur und eine bis zu 4,6-fach erhöhte Resistenz gegenüber Harnstoff und Guanidinhydrochlorid, im Vergleich zur SaSrtA Variante rM4, aufweist. CyM6 erzielte bei der Ligation von Peptid und primären Aminen, unter Denaturierungsbedingungen, eine bis zu 2,6-fach höhere Ausbeute an Konjugat (im Vergleich zur rM4-Variante).