Ein kolorimetrischer Assay ermöglicht Hochdurchsatz-Screening zur gelenkten Evolution von Prodigiosin-Ligase PigC

09.07.2020
  Stefanie Brands Urheberrecht: BioVI

Stefanie Brands, Hannah U. C. Brass, Andreas S. Klein, Jörg Pietruszka, Anna Joëlle Ruff und Ulrich Schwaneberg, “A colourimetric high-throughput screening system for directed evolution of prodigiosin ligase PigC,” Chem. Commun., 2020, doi: 10.1039/D0CC02181D.

Der farbbasierte PigC-Screening-Assay macht die Evolution von Ligasen zur Kondensation bioaktiver Prodiginine möglich.

 
  Schema des PigC-Screening Assays. Urheberrecht: Chem. Commun. Rote aktive Kolonien werden vorselektiert, um im 96-Well Format photometrisch getestet zu werden.

Die Prodigiosin-Synthetase PigC ist eine membrangebundene ATP-Ligase, die den finalen Kondensationsschritt im Prodigiosin-Biosynthesewegs katalysiert - eines tripyrrolischen roten Pigments, das in der Natur von mehreren Bakterienarten synthetisiert wird. Die Verbindungsklasse der Prodiginine ist bekannt für ihre intensivrote Farbe, die Kolonien von Prodiginin-produzierenden Bakterien wie kleine Blutstropfen erscheinen lässt. Bisher wurden mehrere Bioaktivitäten von Prodigininen entdeckt, die die Tripyrrole in den Fokus der Industrie rücken: Ein künstliches Prodiginin-Derivat, Obatoclax Mesylate GX15-070, wird derzeit in der klinischen Studien der Phase-II als Kandidat für die Behandlung verschiedener Krebsarten getestet.

Da die chemische Synthese von Prodigininen leider nicht trivial ist, bleibt die Biokatalyse ein vielversprechender Ansatz, um die Verbindungen zu generieren. In unserem PigC-Screening-Assay kombinierten wir chemische Synthese von Prodiginin-Vorläufermolekülen (die in Verdünnung farblos sind) mit PigC-Biokatalyse (bei der die roten Prodiginine gebildet werden). In einem Kolonie-Vorscreening auf Agarplatten werden aktive rote Klone zur Expression im 96-Well-Format vorselektiert. Nach Zugabe der pyrrolischen Substrate und der Biokatalyse werden die Prodiginine extrahiert und basierend auf ihrer roten Farbe photometrisch quantifiziert.

Dieses Assaykonzept macht den Austausch eines pyrrolischen Vorläufers durch ein vielversprechenderes Pyrrolderivat möglich. In dieser Arbeit haben wir mit 2,3-Dimethylpyrrol anstelle des natürlichen PigC-Substrats 2-Methyl-3-Amylpyrrol gescreent - die resultierenden kurzkettigen Prodiginine zeigten in Autophagietests eine erhöhte Bioaktivität. Da 2,3-Dimethylpyrrol von PigC allerdings nicht ohne weiteres als Substrat akzeptiert wird, sind PigC-Engineeringkampagnen erforderlich, um das Substratspektrum der Synthetase anzupassen. Hierzu ist ein geeignetes Hochdurchsatz-Screening-Verfahren zur Identifizierung verbesserter PigC-Varianten essentiell: In Pseudomonas putida KT2440, im Vergleich zu E. coli einem prodigininresistenteren Expressionschassis, wurde durch Zufallsmutagenese eine PigC-Bibliothek erstellt und nach PigC-Varianten gescreent, deren Akzeptanz des Prodiginin-Vorläufers Dimethyl-Pyrrol im Vergleich zum Wildtyp erhöht ist. Nach Durchmusterung von fast 3000 Klonen wurde die Variante L466Q mit einem Aminosäureaustausch in der Substratbindungsdomäne von PigC entdeckt, die eine fast 3-fach erhöhte Prodigininkonzentration hervorbrachte. Die katalytische Effizienz der Variante mit DiMe-Pyrrol (KM / kcat) war gegenüber dem Wildtyp 2,9-fach erhöht, und auch die Stabilität von L466Q bei 30 ° C war leicht erhöht.

Diese Veröffentlichung wurde in der Abteilung Molekulare Bioökonomie verfasst. Die wissenschaftlichen Aktivitäten des Bioeconomy Science Center wurden vom Ministerium für Kultur und Wissenschaft im Rahmen des NRW Strategieprojekt BioSC (Nr. 313 / 323-400-00213) finanziell unterstützt.