Eine auf Durchflusszytometrie basierende Ultrahochdurchsatz-Screening-Methode für die gerichtete Evolution von Oxidasen
Lilin Feng, Liang Gao, Volkan Besirlioglu, Khalil Essani, Wittwer Malte, Tetiana Kurkina, Yu Ji, and Ulrich Schwaneberg
Ein vielseitiges und robustes Screening-System auf Basis der Durchflusszytometrie für die Entwicklung von Wasserstoffperoxid produzierenden Oxidasen
Oxidasen sind für die chemische und pharmazeutische Industrie von hohem Interesse, da sie hochselektive Oxidationen katalysieren. In der Natur vorkommende Oxidasen müssen jedoch häufig für synthetische Anwendungen maßgeschneidert werden. Hierfür haben wir die vielseitige und robuste, auf Durchflusszytometrie basierende Screening-Plattform "FlOxi" für die gezielte Oxidase-Evolution entwickelt. FlOxi nutzt Wasserstoffperoxid, das von in E. coli exprimierten Oxidasen produziert wird, um Fe2+ zu Fe3+ zu oxidieren (Fenton-Reaktion). Fe3+ vermittelt die Immobilisierung eines His6-getaggten eGFP (eGFPHis) auf der E. coli -Zelloberfläche, wodurch die Identifizierung verbesserter Oxidase-Varianten durch Durchflusszytometrie gewährleistet wird. FlOxi wurde mit zwei Oxidasen validiert, einer Galaktose-Oxidase (GalOx) und einer D-Aminosäure-Oxidase (D-AAO). Hierbei konnte eine GalOx-Variante (T521A) mit einem 4,4-fach niedrigeren Km -Wert und eine D-AAO-Variante (L86M/G14/A48/T205) mit einem 4,2-fach höheren kcat -Wert im Vergleich zu den jeweiligen Wildtypen identifiziert werden. Somit kann FlOxi für die Gerichtete Evolution von Wasserstoffperoxid-produzierenden Oxidasen verwendet und für nicht fluoreszierende Substrate eingesetzt werden.
Lilin Feng und Liang Gao wurden durch ein Promotionsstipendium des China Scholarship Council unterstützt (CSC No.201708330279; No.201708330280).
Weitere Informationen finden Sie in dem vollständigen Dokument unter Veröffentlichungen und Patente
Lilin Feng, Liang Gao, Volkan Besirlioglu, Khalil Essani, Wittwer Malte, Tetiana Kurkina, Yu Ji, and Ulrich Schwaneberg, Angewandte Chemie International Edition, doi.org/10.1002/ange.202214999
Eine Ultrahochdurchsatz-Screening-Plattform "FlOxi" wurde entwickelt, indem eine Oxidations-/Fenton-Reaktionskaskade, Fe3+-vermittelte eGFPHis-Immobilisierung und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung in einer Strategie vereinigt wurden. FlOxi wurde in zwei Evolutionskampagnen für zwei Oxidasen validiert, was die Eignung der Plattform für das Screening von Oxidase-Varianten im Ultra-Hochdurchsatzverfahren belegt.