Publikationshighlights

  Ulrich Markel Urheberrecht: BioVI Ulrich Markel

Ulrich Markel, Khalil D. Essani, Volkan Besirlioglu, Johannes Schiffels, Wolfgang R. Streit and Ulrich Schwaneberg*, Chem. Soc. Rev., 2020, 49, 233-262. DOI:10.1039/C8CS00981C

In diesem Review fassen wir aktuelle und vielversprechende Ultrahochdurchsatz-Methoden zum Screening großer Bibliotheken in der gelenkten Evolution von Enzymen zusammen.

 
  Ultrahochdurchsatz-Screening für die gelenkte Evolution von Enzymen Urheberrecht: Chemical Society Reviews Aktuelle Ultrahochdurchsatz-Screening Methoden nutzen Zellen und biomimetische Kompartimente für die gelenkte Evolution von Enzymen und sind vielversprechend für die funktionelle Metagenomik.

Enzyme müssen oft optimiert werden, um ihr volles Potenzial auszuschöpfen. (Semi-)rationales Design erfordert detaillierte Kenntnisse über Struktur-Funktions-Beziehungen. Im Gegenzug können gelenkte Evolutionsmethoden die Eigenschaften eines Enzyms ohne strukturelles Wissen durch iterative Runden aus Vielfaltserzeugung und Screening verbessern. Aktuelle Vielfaltserzeugungsmethoden ermöglichen es uns, große Bibliotheken zu generieren, aber konventionelles Screening auf Agarplatten oder in Mikrotiterplatten kann die gesamte generierte Diversität nicht in angemessener Zeit testen. Ultrahochdurchsatz-Screening-Methoden erhöhen drastisch die Anzahl der Enzymvarianten, die wir durchmustern können, beschleunigt so das Design von Biokatalysatorenen und erweitern letztendlich unser Wissen über Sequenz-Funktions-Beziehungen. In diesem Artikel fassen wir die jüngsten Fortschritte beim Ultrahochdurchsatz-Screening für die gerichtete Evolution von Enzymen zusammen. Wir diskutieren die Bedeutung von Kompartimenten für die Verknüpfung von Genotyp und Phänotyp und veranschaulichen, wie Zellen und biomimetische Kompartimente diese Funktion erfüllen können. Abschließend diskutieren wir, wie neue Ansätze der funktionellen Metagenomik vom Ultrahochdurchsatz-Screening profitieren können, um natürliche Biokatalysatoren für neuartige chemische Transformationen finden zu können.

 

Chemoenzymatische Kaskade zur Stilben-Produktion aus Zimtsäure durch eine Ferulasäure-Decarboxylase und eine artifizielle Metathease

Daniel Sauer, Stephanie Mertens Urheberrecht: BIO VI Daniel Sauer und Stephanie Mertens

M. A. Stephanie Mertens,‡ Daniel F. Sauer,‡ Ulrich Markel, Johannes Schiffels, Jun Okuda,* Ulrich Schwaneberg,* Catalysis Science & Technology, 2019, DOI: 10.1039/C9CY01412H

Kombination einer Decarboxylase und einer artifiziellen Metathease in einer chemoenzymatischen Kaskadenreaktion für Stilben-Produktion mit effizienter Entfernung von Metallkontaminationen.

 
  Chemoenzymatische Kaskade zur Stilben-Produktion aus Zimtsäure durch eine Ferulasäure-Decarboxylase und eine artifizielle Metathease Urheberrecht: Catalysis Science & Technology Kombination einer Decarboxylase und artifiziellen Metathease in einer chemoenzymatischen Kaskadenreaktion zur Stilben-Produktion

Die Kombination eines Biokatalysators und Biohybridkatalysators in einer chemoenzymatischen Kaskadenreaktion ermöglichte die Produktion von Stilben-Derivaten. Die schrittweise Umsetzung des nachwachsenden Rohstoffs Zimtsäure zu wertvollen Verbindungen wurde in einem Topf unter milden Reaktionsbedingungen in wässrigem Medium erreicht. Die Ferulasäure-Decarboxylase FDC1 aus Saccharomyces cerevisiae wurde zum Umsatz von Zimtsäure genutzt. Der Decarboxylierung folgte eine Kreuz-Metathese des Styrol-Intermediates durch eine artifizielle Metathease, FhuA-GH. Sie basierte auf einem Grubbs-Hoveyda-Katalysator, der in eine veränderte Variante des Transmembranproteins Ferric hydroxamate uptake protein component A, FhuA, eingebettet war. Eine Zwischenaufarbeitung oder Isolation der Styrol-Intermediate war nicht notwendig, da beide Reaktionsschritte in wässrigem Medium stattfinden. Im Vergleich zu einem proteinfreien Katalysator zeigten Kaskadenreaktionen mit der artifiziellen Metathease nach einem Extraktionsschritt einen signifikant niedrigeren Metallgehalt. Die Kaskadenreaktion ist das erste Beispiel der Kombination eines Biokatalysators und eines Biohybridkatalysators für die effiziente Entfernung von Metallverunreinigungen in der Produktfraktion.

 

Maßgeschneiderter Membrankanal ermöglicht chirale Trennung von Racematen

Foto von Deepak Anand Urheberrecht: BioVI Deepak Anand

Deepak Anand, Gaurao V. Dhoke, Julia Gehrmann, Tayebeh M. Garakani, Mehdi D. Davari, Marco Bocola, Leilei Zhu und Ulrich Schwaneberg, Chemical Communications, 2019. DOI: 10.1039/c9cc00154a.

Die chirale Trennung der Argininenantiomere wurde durch das maßgeschneiderte Escherichia coli Membranprotein FhuA erreicht.

 
  Schematische Darstellung der chiralen Trennung eines Arginin-Racemats durch den entwickelten FhuA-Kanal. Urheberrecht: Chem. Commun. Schematische Darstellung der chiralen Trennung eines Arginin-Racemats durch den entwickelten FhuA-Kanal.

Chirale Moleküle sind von großem wirtschaftlichen Wert in der chemischen, pharmazeutischen und Lebensmittelindustrie. Die Trennung von Enantiomeren kann mit verschiedenen Methoden erreicht werden, bleibt aber dennoch eine anspruchsvolle Aufgabe. Chirale Protein-Polymer-Membranen wären eine attraktive, kostengünstige und skalierbare Alternative für die chirale Trennung. Die größten Herausforderungen liegen in der Gestaltung von Filterregionen innerhalb der Kanalproteine und der Entwicklung von Durchmusterungssystemen zur Identifizierung chiraler Kanalproteinvarianten. In der vorliegenden Studie berichten wir zum ersten Mal über ein chirales Kanalprotein aus β-Faltblättern, basierend auf Ferric hydroxamate uptake component A - FhuA, einem Außenmembranprotein von E. coli. Zwei Filterregionen wurden identifiziert und durch die Durchmusterung von Sättigungsmutagenesebibliotheken maßgeschneidert, um die chirale Trennung eines D-/L-Argininin-Racemats zu erreichen. Die Durchmusterung führte zur Identifizierung der FhuAF4-Variante, die einen verbesserten enantiomeren Überschuss von 24% bei 52% Umsatz im Vergleich zur Wildtyp-FhuA-Variante zeigte. Interessanterweise hat schon eine kleine Veränderung von nur zwei Aminosäuren die Selektivität des FhuA-Kanals erheblich beeinflusst. Gesteuerte molekulardynamische Simulationen zeigten, dass die Trennung auf Diffusionsdifferenzen der beiden Enantiomere durch FhuAF4 basiert. Es ist wahrscheinlich, dass mit der identifizierten Filterregion und den Sättigungsbibliotheken weitere Verbesserungen bei der Trennung anderer Aminosäuren und einem breiteren Spektrum an Enantiomeren möglich sind. Die chiralen FhuA-Kanalproteine wären eine hervorragende Arbeitsplattform für die Herstellung von chiralen Membranen auf Basis von Protein-Polymer-Konjugaten mit hohem Potenzial für neuartige und skalierbare Downstream-Prozesse.

Wir danken dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) für die finanzielle Unterstützung des Projekts Chirale Membranen I. Die Simulationen wurden mit Rechenressourcen durchgeführt, die von JARA-HPC von der RWTH Aachen im Rahmen des Projekts RWTH0116 gewährt wurden.

 

Auf dem Weg zur Evolution künstlicher Metalloenzyme - Eine Proteiningenieur-Perspektive

Fotos von Ulrich Markel und Daniel Sauer Urheberrecht: BioVI

Ulrich Markel,# Daniel F. Sauer,# Johannes Schiffels, Jun Okuda und Ulrich Schwaneberg, Ang. Chem. Int. Ed., 2018 , DOI: 10.1002/ange.201811042

In der vorliegenden Veröffentlichung wird ein Überblick über die frühen Ansätze der gelenkten Evolution von Biohybridkatalysatoren gegeben.

 
  Schema zur gelenkten Evolution von Biohybridkatalysatoren Urheberrecht: Ang. Chem. Gelenkte Evolution künstlicher Metalloenzyme/Biohybridkatalysatoren. Im Gegensatz zur gelenkten Evolution natürlicher Enzyme erfordert die gelenkte Evolution künstlicher Metalloenzyme/Biohybridkatalysatoren zwei zusätzliche Schritte (orange).

Der Einbau von künstlichen Metallkofaktoren in Proteingerüste führt zu einer neuen Klasse von Katalysatoren, die als Biohybridkatalysatoren oder künstliche Metalloenzyme bezeichnet werden. Diese Biohybridkatalysatoren können sowohl am künstlichen Cofaktor, als auch an der zweiten Koordinationssphäre, das heißt dem Proteingerüst, modifiziert werden. Protein-Engineering bietet ein enormes Potenzial, um solche Biohybridkatalysatoren maßzuschneidern, erfordert jedoch ein robustes Screening-System und eine wohldurchdachte Metallkofaktor-Konjugationsstratie. In diesem Kurzaufsatz geben wir einen Überblick über die jüngsten Bemühungen auf diesem Gebiet. Wir beschreiben Hochdurchsatz-Screening-Methoden, die für die gelenkte Evolution von Biohybridkatalysatoren angewendet werden und wir veranschaulichen, wie nicht-chirale Katalysatoren Reaktionen enantioselektiv katalysieren, indem wir die ersten Erfolge auf diesem sich entwickelnden Gebiet aufzeigen. Darüber hinaus fassen wir das Potenzial und die bisherigen Limitationen zusammen, die überwunden werden müssen, um von Biohybridkatalysatoren zu echten künstlichen Metalloenzymen zu gelangen.

Finanzielle Förderung von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) durch die internationale Graduiertenschule „Selekitvität in Chemo- und Biokatalyse“ (SeleCa) und durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF, FKZ: 031B0297) wird dankend anerkannt. #: Diese Autoren haben gleichermaßen zu diesem Kurzaufsatz beigetragen.

 

Gelenkte OmniChange Evolution verwandelt P450 BM3 in eine Alkyltrimethylammonium-Hydroxylase

Photo von Yu Ji Urheberrecht: Bio VI Yu Ji, Erstauthorin der Studie zum Thema Gelenkte OmniChange Evolution von P450 BM3 zu einer Alkyltrimethylammonium-Hydroxylase

Yu Ji, Alan Maurice Mertens, Christoph Gertler, Sallama Fekiri, Merve Keser, Daniel F. Sauer, Kilian E. C. Smith, and Ulrich Schwaneberg*, Chemistry - A European Journal, 2018, doi:10.1002/chem. 201803806

 
 

Reengineering der P450 BM3 Substratspezifität zur Hydroxylierung von CTAB durch die OmniChange Multi-Site Mutagenesemethode

  Abbildung der Substrate und Produkte der Reaktion Urheberrecht: Chemistry – A European Journal Gelenkte OmniChange Evolution verwandelt P450 BM3 in eine Alkyltrimethylammonium-Hydroxylase.

Bolatenside sind eine neue Klasse von Verbindungen mit einer breiten Palette von industriellen und technischen Anwendungen. Sie sind in der Lage, sehr kleine Micellen zu bilden und daher wirksamer als moderne Tenside.

Ihre Herstellung ist jedoch teuer und erfordert die Verwendung von starken Säuren und großen Mengen an Lösungsmitteln. Ein alternativer grüner Syntheseweg ist die direkte Hydroxylierung durch Monooxygenasen, wie sie in der Natur durchgeführt wird.

 
 

In dieser Studie wurde die OmniChange Multi-Site-Mutagenesemethode zum Reengineering der P450 BM3-Substratspezifität zur Hydroxylierung von CTAB durch gleichzeitige Mutagenese von vier relevanten Positionen angewendet. Verbesserte Varianten wurden in einem zweistufigen Screeningsystem identifiziert. Anschließend wurden 10 aktive Varianten durch HPLC-MS/MS analysiert. Vier P450 BM3-Varianten wiesen signifikant verbesserte Produktivitäten auf und wurden kinetisch charakterisiert.

Interessanterweise waren alle vier Varianten zu di-Hydroxylierung von CTAB fähig und Kopplungseffizienzen von 92.5% wurden erreicht. Insbesondere wurden erstmals Dihydroxylierungsprodukte von CTAB mit Bolatensideigenschaften hergestellt. Bolatenside sind biologisch abbaubare und nachhaltige Tenside mit ausgezeichneten Löslichkeitseigenschaften, die neue Möglichkeiten der Drug-Delivery und/oder Formulierung bieten. Darüber hinaus erwies sich das zweistufige Screening-System als effizient, um die Kopplungseffizienz zu erhöhen, und kann wahrscheinlich in vielen anderen P450-Evolutionskampagnen verwendet werden, um robuste P450-Katalysatoren zu erzeugen. Diese Arbeit wurde druch das China Scholarship Council, Nr. 201608080082, gefördert.

Den Link zu dieser Publikation finden Sie hier.

 
 
 
 
 
 
 
 
 

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In vitro - Hochdurchsatzdurchmusterung mittels Durchflusszytometrie

Eine der größten Herausforderungen in der Gelenkten Evolution für das erfolgreiche Maßschneidern von Biokatalysatoren für industrielle Anwendungen ist die ultrahohe Durchsatzdurchmusterung, ultrahigh throughput screening, uHTS. uHTS ermöglicht die Analyse von bis zu 107 Ereignissen/Stunde, wodurch die Abdeckung des generierten Proteinsequenzraumes sichergestellt wird. Die Kombination von Durchflusszytometer-basiertem uHTS und zellfreier Enzymproduktion löst das Problem des Diversitätsverlusts durch Transformation der Mutantenbibliotheken in den Expressionswirt und ermöglicht zugleich die Gelenkte Evolution von toxischen Enzymen, und hält das Versprechen auf effiziente Art und Weise Enzyme von humanem oder tierischen Ursprungs zu designen. Dies ist der erste Bericht in dem ein Durchflusszytometer-basiertes uHTS-System in Kombination mit zellfreier Enzymexpression in Emulsionskompartimenten, genannt InVitroFlow, zur Gelenkten Evolution einer Zellulase benutzt wurde. Eine celA2-Mutantenbibliothek mit hoher Mutageneserate wurde hergestellt und in Doppelemulsions-Kompartimenten zusammen mit fluorigenem Substrat und zellfreiem Expressionsreaktionsgemisch eingekapselt, siehe hierzu Abb. 4, Schritt 1-3. Die Kompartimentalisierung gewährleistet das Fortbestehen der Genotyp-Phänotyp Verbindung, da Gen, Enzym, welches vom Gen kodiert wird, sowie umgesetztes fluoreszentes Produkt in ein und demselben Kompartiment eingekapselt werden. Kompartimente, welche aktive Enzymvarianten enthalten können mittels Durchflusszytometer, basierend auf der Entwicklung eines fluoreszenten Produktes sortiert werden, siehe hierzu Abb. 4, Schritt 4. Die Gene, die in den sortierten Kompartimenten vorliegen können mittels PCR Amplifikation isoliert werden und dienen anschließend als Matrize für weitere Runden der Gelenkten Evolution und/oder können in einen Vektor kloniert und im Anschluss in einen Expressionswirt für eine MTP-basierte Durchmusterung transformiert werden, siehe hierzu Abb. 4, Schritt 5-7.

  HTS-Plattform Urheberrecht: Bio VI  

Abbildung 4: InVitroFlow Durchmusterungsplattform in 7 Schritten.Erstellung einer Mutantenbibliothek - Punkt 1, Einkapselung in Einfach- Wasser-in-Öl - Punkt 2, und Wasser-in-Öl-in-Wasser Doppelemulsions-Kompartimente - Punkt 3, Analyse und Sortierung der fluoreszierenden Kompartimente unter Verwendung des Durchflusszytometers - Punkt 4. Isolation und Amplifikation der für aktive Enzym-Varianten kodierenden DNA mittels PCR - Punkt 5, mit darauffolgender Klonierung und Transformation - Punkt 6, für eine Feincharakterisierung im MTP-Assay Format - Punkt 7, oder für darauf folgende, iterative Runden Gelenkter Evolution. Abbildung aus Körfer et al., In vitro flow cytometry-based screening platform for cellulase engineering, Sci. Rep. 2016 - 6: 26128.

Die neuartige InVitroFlow Durchmusterungsplattform wurde durch Screening einer Zufallsmutanten-Bibliothek validiert und verbesserte Zellulase-Varianten, z.B. CelA2-H288F-M1, N273D/H288F/N468S, mit 13,3-fach gesteigerter spezifischer Aktivität im Vergleich zum CelA2-Wildtyp wurden aufgefunden.

Weiterführende Informationen finden Sie in der folgenden Publikation

Körfer, G., Pitzler, C., Vojcic, L., Martinez, R., and Schwaneberg, U. 2016. In vitro flow cytometry-based screening platform for cellulase engineering Sci Rep. 6:26128.

 

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Hochdurchsatz-Durchmusterung mit "Fur Shell" Hydrogelen

Hochdurchsatz-Durchmusterungsformate spielen in Gelenkten Evolutionsexperimenten und bei der Entdeckung von neuartigen Enzymen eine entscheidende Rolle. Ein Hochdurchsatz-Durchmusterungssystem, basierend auf der Formation von fluoreszentem Hydrogel Fur-Shell um E. coli Zellen herum, die aktives Enzym exprimieren, wurde für eine Phytase etabliert. Anschließend wurde die Durchmusterungsplattform zu einer generellen „Fur-Shell-basierten Durchmusterungs-Toolbox“ für die Gelenkte Evolution von Hydrolasen, z.B. Zellulase, Esterase, und Lipase weiterentwickelt. Zellen, die aktive Hydrolase produzieren, generieren ß-D-Glukose von Glukose-abgeleiteten Substraten wie in Abb. 3A dargestellt, welche folglich durch Glukoseoxidase unter Produktion von Wasserstoffperoxid umgesetzt wird wie in Abb. 3B dargestellt. Wasserstoffperoxid dient als Quelle für Hydroxyl-Radikale, welche die Formation des fluoreszenten Hydrogel um E. coli Zellen initiieren, die aktive Hydrolase-Varianten exprimieren - siehe Abb. 1C.

 
  FurShell assay Urheberrecht: Bio VI
 
 

Abbildung 3: Prinzip der Fur-Shell Technologie unter Verwendung einer gekoppelten Enzyme/GOx Reaktion, welche zur Formation eines fluoreszenten Hydrogels führt.

Die Technologieplattform wurde mittels Durchmusterung einer epPCR Bibliothek für Phytase validiert, sowie für insgesamt vier Hydrolasen, Zellulase, Esterase, und Lipase eingesetzt, wobei in einer einzigen Runde Gelenkter Evolution bereits 1.3 – 7-fache verbesserte Enzym-Varianten aufgefunden wurden. Die vorgestellte Fur-Shell Durchmusterungsplattform ist ein wertvolles Pre-Screening System zur Isolation von aktiven Enzym-Varianten unter Reduzierung des Durchmusterungsaufwands auf Kosten-effiziente Art und Weise.

Die Fur-Shell Durchmusterungsplattform ist eine generelle Plattform für die Gelenkte Hydrolase-Evolution, die einfach zu Hand haben, sowie Zeit-effizient im Vergleich zu anderen, berichteten Durchflusszytometer-basierten Durchmusterungssystemen für die Gelenkte Evolution ist. Das Prinzip der Fur-Shell Technologie kann an andere Enzymklassen adaptiert werden und hat Potential ein Standard-Durchmusterungsformat in der Gelenkten Proteinevolution zu werden. Die Hochdurchsatzdurchmusterung wird durch diese Technologie ermöglicht und erlaubt die Erforschung bzw. den Einsatz von neuartigen Mutagenese-Strategien und die Durchmusterung des Proteinsequenzraums für kurze Peptide. Zusätzlich eignet sich die entwickelte Plattform für Anwendungen im Bereich der Bio-basierten, interaktiven Materialien, da sie auf der gerichteten Bildung einer E. coli Polymer Kapsel basiert.

Weiterführende Informationen zum Thema Hochdurchsatz-Durchmusterung finden Sie in diesen Publikationen:

Lülsdorf*, N., Pitzler*, C., Biggel, M., Martinez, R., Vojcic, L. and Schwaneberg, U. 2015. A flow cytometer-based whole cell screening toolbox for directed hydrolase evolution through fluorescent hydrogels. Chem Commun. 51, 41:8679-8682.

Pitzler, C., Wirtz, G., Vojcic, L., Hiltl S., Böker, A., Martinez, R., and Schwaneberg, U. 2014. A fluorescent hydrogel-based flow cytometry high-throughput screening platform for hydrolytic enzymes. Chem Biol. 21, 12:1733-1742.