Publikations-Highlights
CompassR: Eine neue Regel für die Rekombination von vorteilhaften Substitutionen in der gelenkten Evolution
Haiyang Cui, Hao Cao, Haiying Cai, Karl Erich Jaeger, Mehdi D. Davari, Ulrich Schwaneberg, Computer‐assisted Recombination (CompassR) teaches us how to recombine beneficial substitutions from directed evolution campaigns, Chemistry A European Journal, 2019, https://doi.org/10.1002/chem.201903994
Die computergestützte Rekombination – CompassR – Strategie ist ein Auswahlfilter für Experimentatoren, vorteilhafte Substitutionen zu rekombinieren, um die Enzymleistung schrittweise zu verbessern und Verbesserungen durch Rekombination zu maximieren.
Die gelenkte Evolution hat sich zu einer leistungsfähigen Methode zur Verbesserung von Enzymen in der Katalyse und in medizinischen Anwendungen entwickelt, wie der Nobelpreis für Chemie 2018 belegt. Eine der wichtigsten verbleibenden Herausforderungen ist die Frage, wie man vorteilhafte Substitutionen rekombinieren kann. Systematische Rekombinationsstudien zeigen, dass weniger leistungsfähige Varianten in der Regel nach der Rekombination von 3 bis 4 vorteilhaften Substitutionen erhalten werden. Letzteres beschränkt die Forscher darin, die Vorteile von vorteilhaften Substitutionen, die in gezielten Evolutionskampagnen identifiziert wurden, zu nutzen und das Potenzial der Natur zur Generierung besserer Enzyme zu nutzen. Die computergestützte Rekombinations – CompassR – Strategie bietet einen Auswahlleitfaden für vorteilhafte Substitutionen, die rekombiniert werden können, um die Enzymleistung durch Analyse der relativen freien Faltungsenergie schrittweise zu verbessern. Die Eignung von CompassR wurde durch die Analyse von 84 Rekombinanten an 13 Positionen der Bacillus subtilis Lipase A bewertet. Die Analyse ihrer relativen freien Faltungsenergie wurde verwendet, um die CompassR-Regel abzuleiten, dass Substitutionen mit einer relativen freien Faltungsenergie unter +0,36 kcal/mol effizient rekombiniert werden können, Varianten mit einer freien Faltungsenergie zwischen +0,36 und +7,52 kcal/mol aktiv und inaktiv waren und somit unvorhersehbares Verhalten anzeigten. Freie Faltungsenergien über +7,52 kcal/mol ergaben hauptsächlich inaktive Varianten. Die finale Rekombinante mit vier Aminosäuresubstitutionen hatte eine 2,7-fach verbesserte spezifische Aktivität in 18,3 % ionischer Flüssigkeit [BMIM][Cl]. Insbesondere die BSLA-Varianten mit 3 und 4 Substitutionen waren leistungsfähiger als die Varianten mit 2 Substitutionen. Im Wesentlichen ermöglicht die neue CompassR-Regel die iterative Rekombination vorteilhafter Substitutionen und ermöglicht es Forschern, Enzymverbesserungen zeiteffizient zu erzielen.
Diese Arbeit wurde in der Abteilung Computational Biology durchgeführt und durch die von JARA-HPC von der RWTH Aachen (JARA0187) zur Verfügung gestellten Rechenressourcen unterstützt. Haiyang Cui wird finanziell durch das Stipendium des China Scholarship Council (CSC) unterstützt.
Molekulares Verständnis der Interaktionen eines Enzyms und ionischer Flüssigkeiten bietet eine generelle Strategie zur Proteinoptimierung für nachhaltige biokatalytische Anwendungen
Pramanik S.†, Dhoke G. V.†, Jaeger KE., Schwaneberg U., Davari MD. ACS Sustainable Chem. Eng., 2019, https://doi.org/10.1021/acssuschemeng.9b00752 †geteilte Erstautorschaft
Das molekulare Verständnis der Interaktionen von Enzymen mit ionischen Flüssigkeiten aus computer-basierten Studien ist anwendbar für generelle Proteinoptimierungsstrategien.
In dieser Publikation wurden mit Hilfe Molekulardynamik-Simulation die Interaktion der Bacillus subtilis Lipase A (BSLA) mit vier Imidazol-basierten ionischen Flüssigkeiten studiert. Diese Studie bietet erste Hinweise, dass ionische Co-Lösungsmittel die generelle und lokale Konformation des Enzyms nicht beeinflussen. Der Effekt der Aktivitätsreduzierung wurde Oberflächeninteraktionen des Enzyms mit den Kationen der ionischen Lösung zugeschrieben, die essentielle Wassermoleküle auf der BSLA Oberfläche entfernten. Der Vergleich von simulations-basierten Daten mit experimentellen Daten einer vollständigen Sättigunsmutagenese-Bibliothek belegten, dass die meisten Positionen für eine verbesserte Resistenz in der Nähe von Binderegionen für Kationen der ionischen Flüssigkeiten liegen. Zusammengefasst legen diese Analysen nahe, dass die Optimierung von Enzym-Oberflächenladungen eine generelle Strategie für die Verbesserung der BSLA in ionischen Flüssigkeiten darstellen könnte und das diese Strategie auch auf weitere Lipasen und α/β-Hydrolasen übertragbar sein könnte.
Diese Arbeit wurde in der Abteilung Computational Biology durchgeführt und wurde durch JARA-HPC der RWTH Aachen (JARA0187) finanziell unterstützt.
Enzym-Polyelektrolyt-Komplexe erhöhen die katalytische Leistung von Enzymen
Martin J. Thiele, Mehdi D. Davari, Melanie König, Isabell Hofmann, Niklas O. Junker, Tayebeh Mirzaei Garakani, Ljubica Vojcic, Jörg Fitter, Ulrich Schwaneberg, ACS Catalysis, 2018, DOI: 10.1021/acscatal.8b02935
In der vorliegenden Veröffentlichung wird über das molekulare Verständnis von Polyelektrolyt-Enzym-Komplexen berichtet, die die enzymatische Aktivität in Mehrkomponentensystemen verstärken.
In dieser Veröffentlichung wurde ein molekulares Verständnis der verstärkenden Wirkung von Polyacrylsäure, PAA, und γ-Polyglutaminsäure, γ-PGA auf eine unspezifische Subtilisin Protease durch biophysikalische Charakterisierung, z.B. Fluoreszenzkorrelations- und Circulardichroismus-Spektroskopien sowie isotherme Titrationskalorimetrie, Molekulardynamiksimulationen und Protease-Engineering, z.B. Ortssättigungsmutagenese, geschaffen. Diese Studie zeigte, dass enthalpisch getriebene Wechselwirkungen über Schlüssel-Aminosäurereste in der Nähe der Protease-Ca2+-Bindungsstellen den Verstärkungseffekt in der Protease-Aktivität verursachen. Auf molekularer Ebene führen elektrostatische Wechselwirkungen zur Bildung von Protease-Polyelektrolyt-Komplexen. Eine Sättigungsmutagenese an 6 Positionen führte zu Varianten mit erhöhter proteolytischer Leistung gegenüber einer komplexen Proteinmischung mit dem Handelsnamen CO3 um bis zu ~ 300% und ~ 70% in Anwesenheit von PAA und γ-PGA. Die Fähigkeit, die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und negativ geladenen Polymeren durch integrativen Einsatz von Computerdesign, Protein-Engineering und biophysikalischer Charakterisierung zu optimieren, erwies sich als effizienter Arbeitsablauf zur Verbesserung der Proteaseleistung.
Diese Forschung wurde teilweise von der Henkel AG & Co. KGaA, Düsseldorf, Deutschland, im Rahmen des Projekts Henkel Innovation Campus für Advanced Sustainable Technologies (HICAST) finanziert. Simulationen wurden mit Rechenressourcen durchgeführt, die von JARA-HPC durch die RWTH Aachen University im Rahmen der Projekte RWTH0116 und JARA0169 erteilt wurden.
Enzymkompatible dynamische Nanoreaktoren aus elektrostatisch verbrückten gleichgeladenen Tensiden und Polyelektrolyten
Martin J. Thiele, Mehdi D. Davari, Isabell Hofmann, Melanie König, Carlos G. Lopez, Ljubica Vojcic, Walter Richtering, Ulrich Schwaneberg und Larisa A. Tsarkova, Angewandte Chemie, 2018, DOI: 10.1002/anie.201805021
In unserer neusten Veröffentlichung wird über die Entdeckung von Nanoreaktoren aus elektrostatisch verbundenen Tensiden und Polyelektrolyten gleicher Ladung berichtet. Der Einbau einer Protease in solche dynamischen Nanoreaktoren führt zu einer synergistisch verbesserten Reinigungsleistung aufgrund der verbesserten Solubilisierung und Zugänglichkeit für die Protease durch die Wechselwirkung mit den Nanoreaktor-Komponenten.
In der Publikation wird von einem völlig unerwarteten Mechanismus von sich anziehenden elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen vollständig neutralisierter Polyacrylsäure und gleich geladenen Tensiden berichtet. Amphiphile Polymer-Tensid-Komplexe mit hoher Grenzflächenaktivität und einer Solubilisierungskapazität, die die herkömmlicher Mizellen übersteigt, werden durch Brückenbildung mit Kalzium-Ionen gebildet. Der Einbau einer unspezifischen Protease in solche dynamischen Nanoreaktoren führt zu einer synergistisch verbesserten Reinigungsleistung aufgrund der verbesserten Solubilisierung von schlecht wasserlöslichen immobilisierten Proteinen. Konkurrierende Grenzflächen- und intermolekulare Wechselwirkungen wurden auf verschiedenen Zeit- und Längenskalen mit kolorimetrischen Analysen, dynamischer Tensiometrie, Lichtstreuung und molekulardynamischen Simulationen untersucht. Der hier entdeckte Mechanismus der verbrückenden Assoziation schlägt eine Neugestaltung von Tensid / Polymer / Enzym-Formulierungen moderner Detergenzien vor und eröffnet neue Möglichkeiten bei der Entwicklung labiler Abgabesysteme.
Links: Schema des Mechanismus von anziehenden elektrostatischen Wechselwirkungen vollständig neutralisierter Polyacrylsäure (PAA) mit dem gleich-geladenen Tensid SLES. Amphiphile Polymer-Tensid-Komplexe mit hoher Grenzflächenaktivität und Solubilisierungskapazität werden durch Brückenbildung mit Ca 2+ -Ionen gebildet. Einbau einer Protease in solche dynamischen Nanoreaktoren führt aufgrund der verbesserten Solubilisierung von schlecht wasserlöslichen immobilisierten Proteinen zu verbesserter Reinigungsleistung.
Diese Forschung wurde teilweise von der Henkel AG & Co. KGaA, Düsseldorf, Deutschland, im Rahmen des Henkel Innovation Campus für Advanced Sustainable Technologies (HICAST) finanziert. Simulationen wurden mit Rechenressourcen durchgeführt, die von JARA-HPC der RWTH Aachen im Rahmen der Projekte RWTH0116 und JARA0169 erteilt wurden. L.A.T. würdigt die finanzielle Unterstützung der Russischen Stiftung für Grundlagenforschung (RFBR) gemäß dem Forschungsprojekt Nr. 18-53-76005.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Molecular docking of substrates is more challenging compared to inhibitors as the reaction mechanism has to be considered. This becomes more pronounced for zinc-dependent enzymes since the coordination state of the catalytic zinc ion is of greater importance. In order to develop a predictive substrate docking protocol, we have performed molecular docking studies of diketone substrates using the catalytic state of carbonyl reductase 2 from Candida parapsilosis CPCR2. Different docking protocols using two docking methods, AutoDock Vina and AutoDock4.2, with two different sets of atomic charges, AM1-BCC and HF-RESP, for catalytic zinc environment and substrates as well as two sets of vdW parameters for zinc ion were examined. We have selected the catalytic binding pose of each substrate by applying mechanism based distance criteria. To compare the performance of the docking protocols, the correlation plots for the binding energies of these catalytic poses were obtained against experimental Vmax values of the 11 diketone substrates for CPCR2. The best correlation of 0.73 was achieved with AutoDock4.2 while treating catalytic zinc ion in optimized non-bonded NBopt state with ?1.01 charge on the zinc ion, compared to 0.36 in non-bonded ?2.00 charge on the zinc ion state. These results indicate the importance of catalytic constraints and charge parameterization of catalytic zinc environment for the prediction of substrate activity in zinc-dependent enzymes by molecular docking. The developed predictive docking protocol described here is in principle generally applicable for the efficient in silico substrate spectra characterization of zinc-dependent ADH.
Rhodium-Complex-Linked Hybrid Biocatalyst:
Stereo-Controlled Phenylacetylene Polymerization within an Engineered Protein Cavity The incorporation of a Rh complex with a maleimide moiety into the cavity of the nitrobindin b-barrel scaffold by a covalent linkage at the 96-position, Cys, provides a hybrid biocatalyst that promotes the polymerization of phenylacetylene.
The appropriate structural optimization of the cavity by mutagenesis enhances the stereoselectivity of the polymer with a trans content of 82% at 258C and pH 8.0. The X-ray crystal structure of one of the hybrid biocatalysts at a resolution of 2.0 reveals that the Rh complex is located in the b-barrel cavity without any perturbation to the total protein structure.
Crystal structure analysis and molecular modeling support the fact that the stereoselectivity is enhanced by the effective control of monomer access to the Rh complex within the limited space of the protein cavity.
Shehzad, A., Panneerselvam, S., Linow, M., Bocola, M., Roccatano, D., Mueller-Dieckmann, J., Wilmanns, M., and Schwaneberg, U. 2013. P450 BM3 crystal structures reveal the role of the charged surface residue Lys/Arg184 in inversion of enantioselective styrene epoxidation. Chem. Commun., 2013, 49, 4694-4696.
Overview of the ten generated NB variants. a - The amino acid residues in the vicinity of the Rh complex within NBQ96C-Rh. Two calculated stable conformations of the Rh complex are shown. The Rh atom and its ligand are represented by pink and purple sticks, respectively. Met75 and Met148 were replaced by Leu in all variants. b - List of re-engineered NB variants for stereoselective PPA synthesis.
Study the enantioselective styrene epoxidation in P450 BM3 and to explore how a single charged surface residue, Lys/Arg184, inverts the enantioselectivity in P450 BM3 variants 5F5K - F87A, T235A, A184K, and 5F5R - F87A, T235A, A184R, as compared to the parent 5F5 - F87A, T235A, variant.
Substitution of Lys/Arg for Ala in 5F5K StB and 5F5R StB structures establishes a salt-bridge between Lys/Arg184 - F-helix, and Asp80 - B’-helix.
The salt-bridge relays structural changes from the surface of P450 BM3 muteins to the active site and stabilizes 5F5K StB and 5F5R StB structures in WTSB forms - reduced I-helix kink angle.
Due to kinked I-helix, Ala264 covers completely the heme pyrrole ring C, and provides sufficient steric hindrance to prevent exposure of the pro-S face of styrene to the heme-iron which, as a result, promotes the formation of R-styrene epoxide as the preferred enantiomer in the 5F5 variant.
Dhoke, G. V., Davari, M. D., Schwaneberg, U., Bocola, M. 2015. QM/MM Calculations Revealing the Resting and Catalytic States in Zinc-Dependent Medium-Chain Dehydrogenases/Reductases. ACS Catalysis, 5, 3207-3215.
Loderer, C., Dhoke, G. V., Davari, M. D., Kroutil, W., Schwaneberg, U., Bocola, M., Ansorge-Schumacher, M. B. 2015. Investigation of structural determinants for the substrate specificity in the zinc-dependent alcohol dehydrogenase CPCR2 from Candida parapsilosis. ChemBioChem, 16, 1512-1519.
Dhoke, G. V., Loderer, C., Davari, M. D., Ansorge-Schumacher, M., Schwaneberg, U., Bocola, M. 2015. Activity prediction of substrates in NADH-dependent carbonyl reductase by docking requires catalytic constraints and charge parameterization of catalytic zinc environment. J. Comput. Aided Mol. Des., 29, 1057-1069