Eine Schleifen-Engineering-Strategie verbessert die Aktivität der Laccase lcc2 in ionischen Flüssigkeiten und wässrigen Lösungen
A. M. Wallraf, H. Liu, L. Zhu, G. Khalfallaha, C. Simons, H. Alibiglou, M. D. Davari and U. Schwaneberg, Green Chemistry, 2018, DOI: 10.1039/C7GC03776G
Es konnte eine Domänenverbindungsschleife innerhalb der Laccase identifiziert werden, die für die Enzymaktivität in ionischen Flüssigkeiten von großer Bedeutung ist.
Laccasen sind am Ligninabbau beteiligt. Mit EMI- und BMIM-basierten ionischen Flüssigkeiten kann Holzbiomasse effizient verflüssigt werden, während gleichzeitig aber die Laccaseaktivität durch die ionischen Flüssigkeiten drastisch reduziert wird. Ein vielversprechender Ansatz zur Verbesserung der Aktivität und Resistenz von Laccasen in ionischen Flüssigkeiten ist das Protein Engineering, durch das die Ligninvalorisierung für die nachhaltige Produktion von Kraftstoffen und hochwertigen Bulk-Chemikalien effizienter gestaltet werden kann. Wir berichten erstmals über ein effizientes semi-rationales Design mit Fokus auf eine Domänenverbindungsschleife der Laccase lcc2 (Schleife L1) aus der Schmetterlings-Tramete Trametes versicolor.
Die Strategie des Schleifen-Engineerings basiert auf einer KnowVolution-Kampagne und kann in drei Schritte unterteilt werden. Die Vorhersage von sieben resistenzsteigernden Positionen der 37 Aminosäuren in L1 (Reste 284-320) wurde mittels in silico SSM-Analyse mit FoldX durchgeführt. Diese sieben Positionen wurden zunächst einzeln gesättigt. Daraufhin wurden vier der sieben vorteilhaften Positionen gleichzeitig unter Verwendung von OmniChange mithilfe gerichteter Mutagenese gesättigt. Die OmniChange-Varianten OM1 (A285P / A310R / A312E / A318G) und OM3 (A310D / A312P / A318R) zeigten eine um 3,9fache (535,8 ± 36,9 U / mg) bzw. 1,6-fach (216,8 ± 5,3 U / mg) erhöhte spezifische Aktivität in wässriger Lösung (lcc2 WT, 138,9 ± 6,5 U / mg) bzw. bis zu 8,4-fach erhöhte Aktivität in (35% (v / v)) EMIM EtSO4 und wässrige Lösung im Vergleich zu lcc2 WT. Die computergestützte Analyse des Wasserstoffbindungsmusters zeigte, dass beide Varianten eine erhöhte Anzahl von Wasserstoffbrücken innerhalb der Schleife und zwischen den Domänen zwei und drei aufwiesen, was zu einer erhöhten Resistenz gegenüber ionischen Flüssigkeiten führte.
Eine Entropieanalyse zeigte, dass die Substitution von Alanin an jeder ausgewählten Aminosäureposition A285, A310, A312 und A318 die Flexibilität der Schleife L1 reduziert. Die Analyse mit dem ConSurf-Server zeigte, dass die lange Domänenverbindungsschleife L1 ein konserviertes Merkmal in pilzlichen Laccasen ist, was das Schleifen-Engineering als nützliche Strategie zum Erhöhen der Laccase-Aktivität in ionischen Flüssigkeiten und wässrigen Lösungen nahelegt. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft - DFG - im Rahmen des Forschungsclusters "Maßgeschneiderte Kraftstoffe aus Biomasse" gefördert.
Weitere Informationen zu diesem Artikel finden Sie unter unseren Forschungshighlights. Zugang zum Artikel bekommen Sie auf der Internetpräsenz der Royal Society of Chemistry.