Modulation der Kopplungseffizienz von P450 BM3 durch Steuerung der Wasserdiffusion durch das Engineering der Substratzugangstunnel

09.03.2022
  Shuaiqi Meng und Ju Yi © BIO VI

Meng, S., Ji, Y., Liu, L., Davari, M. D., Schwaneberg, U., ChemSusChem, doi.org/10.1002/cssc.202102434

Die Einführung von hydrophoben Resten in Substratzugangstunnel erhöhte die katalytische Effizienz und Kopplungseffizienz von P450 BM3

Cytochrome P450 sind leistungsstarke Katalysatoren für die Synthese von Pharmazeutika, Kunststoffen und Hormonen, ihre industrielle Anwendung ist jedoch begrenzt. Einer der Hauptengpässe von P450 ist ihre geringe Kopplungseffizienz gegenüber nicht natürlichen Substraten. Es wird davon ausgegangen, dass das Vorhandensein von zusätzlichem Wasser um die aktive Stelle mit der geringen Kopplungseffizienz zusammenhängt. Wir haben die Zugangstunnel von P450 BM3 aus Bacillus megaterium modifiziert, um den Wasserzugang vom Bulk-Lösungsmittel zum aktiven Zentrum zu kontrollieren. Neun in Tunneln befindliche Reste wurden durch Sättigungsmutagenese untersucht, um die Wasserdiffusion zu reduzieren und somit die Kopplungseffizienz zu verbessern. Schließlich zeigte die Variante N319L/T411V/T436Q eine 1,7-fache verbesserte Kopplungseffizienz und eine 1,4-fache Verbesserung der enzymatischen Aktivität gegenüber dem Substrat α-Isophoron im Vergleich zum Wildtyp P450 BM3. Tunnelpolaritätsanalyse und MD-Simulation bewiesen ferner, dass eine reduzierte Anzahl von Wassermolekülen um das aktive Zentrum herum zu einer höheren Kopplungseffizienz führen könnte. Diese Ergebnisse zeigten, dass das Engineering der Substratzugangstunnel eine leistungsstarke Strategie zur Kontrolle der Wasserdiffusion und zur Modulation der Kopplungseffizienz von P450 Katalysatoren ist.

 

Shuaiqi Meng wurde von einem Ph.D. Stipendium des China Scholarship Council (CSC No. 201906880011).

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Meng, S., Ji, Y., Liu, L., Davari, M. D., Schwaneberg, U., ChemSusChem, doi.org/10.1002/cssc.202102434

  Tunnel-Engineering p450 Protein © ChemSusChem
 
 

Abbildung. In die P450 BM3-Zugangstunnel wurden hydrophobe Reste eingeführt, wodurch das Eindringen von zusätzlichem Wasser in die aktive Stelle verringert wurde. Die Zugangstunnel mit erhöhter Hydrophobie zeigen einen positiven Einfluss auf die katalytische Aktivität und Kopplungseffizienz gegenüber der Reaktion von P450 BM3.