Die molekulare Grundlage der spektralen Abstimmung in blau- und rotverschobenen Flavin-bindenden fluoreszierenden Proteinen

24.09.2021
 

Röllen, K., Granzin, J., Remeeva A., Davari, M. D., Gensch, T., Nazarenko V. V., Kovalev, K., Bogorodskiy, A., Borshchevskiy, V., Hemmer, S., Schwaneberg, U., Gordeliy, V., Jaeger, K. E., Batra-Safferling, R., Gushchin, I., Krauss, U., Journal of Biological Chemistry, doi.org/10.1016/j.jbc.2021.100662

Blau- und rotverschobene Varianten des Flavin-bindenden fluoreszierenden Proteins sind vielversprechende Werkzeuge für Anwendungen in den Biowissenschaften.

Photoaktive biologische Systeme verändern die optischen Eigenschaften ihrer Chromophore, was als spektrale Abstimmung bezeichnet wird. Die Bestimmung des molekularen Ursprungs der spektralen Abstimmung ist entscheidend für das Verständnis der Funktion und die Entwicklung von Anwendungen für diese Biomoleküle. Die spektrale Abstimmung von Flavin-bindenden fluoreszierenden Proteinen (FbFPs), einer aufstrebenden Klasse von fluoreszierenden Reportern, ist durch ihre Abhängigkeit von proteingebundenen Flavinen begrenzt, deren Struktur und damit elektronische Eigenschaften nicht durch Mutationen verändert werden können. Eine blauverschobene Variante des aus Pflanzen stammenden verbesserten Licht-, Sauerstoff- und Spannungs-FbFP wurde durch die Einführung eines Lysins in die Flavin-Bindungstasche geschaffen. Die molekulare Grundlage dieser Verschiebung ist noch nicht geklärt. In dieser Arbeit wird die blauverschobene verbesserte Licht-Sauerstoff-Spannungs-Variante strukturell charakterisiert und ein neues blauverschobenes CagFbFP-Protein wird durch Einführung einer analogen Mutation konstruiert. Die Röntgenstrukturen beider Proteine zeigen, dass die Verschiebung des Lysins weg vom Chromophor und die Öffnung der Struktur für die Blauverschiebung verantwortlich sind. Die Strukturanalyse ergab, dass die Lysin-Seitenkette der blau verschobenen Variante durch eine weitere Mutation in der Nähe des Flavins stabilisiert wird, was für die Rotverschiebung verantwortlich ist. Somit reicht eine einzige zusätzliche Mutation aus, um aus einer blauverschobenen Variante ein rotverschobenes FbFP zu erzeugen. Mithilfe von Spektroskopie, Röntgenkristallographie und quantenmechanischen Berechnungen der Molekularmechanik liefern wir ein solides strukturelles und funktionelles Verständnis der spektralen Abstimmung in FbFPs. Wir zeigen auch, dass die identifizierten blau- und rotverschobenen Varianten eine Zweifarben-Mikroskopie auf der Grundlage der spektralen Trennung erlauben. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die erzeugten blau- und rotverschobenen Varianten vielversprechende neue Werkzeuge für zahlreiche Anwendung in den Biowissenschaften darstellen.

Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Training Group 1166 “BioNoCo” (Biocatalysis in Non-conventional Media) finanziell unterstützt und in Kollaboration mit dem Institut für Molekulare Enzymtechnologie, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, IBI-7: Structural Biochemistry, Forschungszentrum Jülich GmbH, Jülich, Germany; JuStruct: Jülich Center for Structural Biology, Forschungszentrum Jülich, Jülich, Germany; Research Center for Molecular Mechanisms of Aging and Age-Related Diseases, Moscow Institute of Physics and Technology, Dolgoprudny, Russia; Institute of Biotechnology, RWTH Aachen University, Aachen, Germany; IBI-1: Molecular and Cellular Physiology, Forschungszentrum Jülich GmbH, Jülich, Germany; Institut de Biologie Structurale Jean-Pierre Ebel, Université Grenoble Alpes-Commissariat à l’Energie Atomique et aux Energies Alternatives–CNRS, Grenoble, France; Institute of Crystallography, RWTH Aachen University, Aachen, Germany; IBG-1: Biotechnology, Forschungszentrum Jülich GmbH, Jülich, Germany; DWI-Leibniz Institute for Interactive Materials, Aachen, Germany realisiert. Diese Arbeit wurde durch Rechenressourcen untersützt, die von JARA-HPC der RWTH Aachen University (JARA0065) bereitgestellt wurden.

Zugang zu der Publikation finden Sie unter Publikationen und Patente und unter

Röllen, K., Granzin, J., Remeeva A., Davari, M. D., Gensch, T., Nazarenko V. V., Kovalev, K., Bogorodskiy, A., Borshchevskiy, V., Hemmer, S., Schwaneberg, U., Gordeliy, V., Jaeger, K. E., Batra-Safferling, R., Gushchin, I., Krauss, U., Journal of Biological Chemistry, doi.org/10.1016/j.jbc.2021.100662