Forschungshighlights

 
 

Ein enzymatischer Weg zu α-Tocopherol Synthonen: Aromatische Hydroxylierung von Pseudocumol und Mesitylen mittels P450 BM3

A.Denning/A.Weingartner Bio VI

Dennig*, A., Weingartner*, A. M., Kardashliev, T., Müller, C. A., Tassano, E., Schürmann, M., Ruff, A. J., Schwaneberg, U. (2017). Chemistry - European Journal , first published online: October 9 2017, DOI: 10.1002/chem.201703647

 
 

P450 BM3 Varianten für die Produktion von phenolischen Schlüsselbausteinen für die α-Tocopherol-Synthese

 
  Hydroxylierung durch P450 BM§ Wiley VCH

Vitamin E findet vielfältige Anwendung, wie zum Bespiel in Kosmetika, in der Lebensmittelindustrie und als Nahrungsergänzungsmittel. Aufgrund des wachsenden Bedarfes sind alternative Wege zur Herstellung von Vitamin E von industriellem Interesse. Mit unserer Arbeit zeigen wir die erste direkte aromatische Hydroxylierung von Pseudocumol und Mesitylen in Wasser, unter Luftsauerstoff und milden Reaktionsbedingungen für die Gewinnung von aromatischen Ausgangsbausteine für die Synthese von Vitamin E. Einer der wichtigsten, aromatischen Bausteine hierfür ist Trimethylhydroquinon - TMHQ. Die beschriebene P450 BM3 Variante M3 ist in der Lage TMHQ direkt von Pseudocumol ausgehend zu produzieren, was eine neue und umweltfreundlichere Vitamin E Synthese ermöglicht. Im Falle von Mesitylen kann eine P450 BM3 katalysierte Oxidation zur Herstellung von nützlichen Bausteinen beitragen, welche wiederum als Ausgangsstoff für die TMHQ Erzeugung genutzt werden können. Zusammenfassend beschreibt die Studie einen ersten enzymatischen Weg für die Herstellung von aromatischen Ausgangsbausteinen für die Vitamin E Synthese und erste katalytische und mechanistische Untersuchungen der direkten aromatischen Hydroxylierung von Trimethylbenzenen mit Luftsauerstoff.

 
 

Umkehrung der Enantiopräferenz von cpADH5 und Veränderung der Kettenlängenspezifität für Methyl-3-Hydroxyalkanoate

Yunus Ensari & Gaurao Dhoke Bio VI

Yunus Ensari, Gaurao V. Dhoke, Mehdi D. Davari, Marco Bocola, Anna Joëlle Ruff, Ulrich Schwaneberg, Chemistry – A European Journal 2017, 23, 51, Issue, 12636-12645.

 
 

Die Vergrößerung der Substratbindetasche von cpADH5 führte zur Umsetzung von Methyl-3-Hydroxyalkanoaten mittlerer Kettenlänge und Umkehrung der Enantiomerpräferenz.

 
  cpADH5 Chemistry – A European Journal Schema 1: Allgemeiner Überblick über das Engineering der Bindetasche von cpADH5

Die selektive Oxidation von primären oder sekundären Alkoholen zu Carbonyl-Verbindungen, z.B. Aldehyden und Ketonen, ist eine Schlüsselreaktion in der organischen Synthese und in der Industrie. Die Oxidation von Alkoholen zu Ketonen kann mit einer Vielzahl von chemischen Oxidationsmethoden effizient durchgeführt werden. Jedoch stellen Selektivität, die Produktion ungewünschter Nebenprodukte, Substratspektrum und Umsetzungsraten bei der Oxidation von Alkoholen immer noch eine große Herausforderung dar. Alkoholdehydrogenasen sind vielversprechende Alternativen zu Metallkatalysatoren und katalysieren reversible Oxidationen von primären und sekundären Alkoholen zu deren korrespondierenden Aldehyden oder Ketonen.

Keton-funktionalisierte Fettsäurederivate sind vielseitige Verbindungen in der organischen Chemie, die als Intermediate und Bausteine in der Herstellung von u.a. pharmazeutischen Wirkstoffen und Detergentien genutzt werden.

Diese Studie stellt die erste durch Protein Engineering überarbeitete Candida parapsilosis Alkoholdeydrogenase - cpADH5 - vor, die Methyl 3-hydroxyhexanoat und Methyl 3-hydroxyoktanoat zu ihren entsprechenden Ketonen effizient oxidieren kann. Diese Reaktionen können durch den Wildtyp von cpADH5 nicht katalysiert werden. In dieser Studie wurde die Substratbindetasche von cpADH5 mutiert und neu designt, um ihr Substratspektrum auf 3-Hydroxy-Fettsäuremethylester – FAME – mit mittleren Kettenlängen von 6 bis 12 Kohlenstoffatomen auszudehnen. Des weiteren beschreiben wir die invertierte Enantiopräferenz der von uns genenerierten cpADH5 Variante für die Oxidation von Methyl-3-Hydroxybutyrat.

 
 

Mikro-Lieferservice für Dünger

Mikro-Lieferservice für Dünger Wiley-VCH

Pflanzen können Dünger nicht nur über die Wurzeln, sondern auch über die Blätter aufnehmen. Über einen längeren Zeitraum gestaltet sich eine Blattdüngung jedoch schwierig. Deutsche Forscher stellen jetzt in der Zeitschrift Angewandte Chemie ein leistungsfähiges Zufuhrsystem für Mikronährstoffe auf Basis biohybrider Mikrogele vor. Spezielle Peptide verankern die „Mikrocontainer“ fest auf der Blattoberfläche, während Bindestellen im Inneren für eine verzögerte Abgabe der „Ladung“ sorgen.

Die Blattdüngung ist bereits Praxis, z.B. im Weinbau, wenn Reben aufgrund eines Mineralmangels gelbe Blätter bekommen. Trotz Verwendung von Detergenzien, Adhäsiven und Befeuchtungsmitteln ist eine kontrollierte Nährstoffzufuhr über mehrere Wochen per Blattdüngung aber kaum zu erreichen. Bis zu 80% der Nährstoffe werden abgewaschen, gelangen in den Boden und werden zum Großteil in Formen umgewandelt, die die Pflanze nicht nutzen kann. Zudem können sie in Gewässer gespült werden und Umweltprobleme verursachen. Ein weiteres Problem: Bei starker Sonneneinstrahlung verdunstet das Wasser der aufgetragenen Düngerlösung. Die entstehende hohe Salzkonzentration entzieht dem Blatt Wasser, was zu Verbrennungsschäden führen kann.

Das Team vom DWI-Leibniz-Institut für Interaktive Materialien, Aachen, der RWTH Aachen und der Universität Bonn hat jetzt ein Blattdünger-System auf Basis biokompatibler Mikrogele entwickelt, das lange und selektiv an Blättern haftet und Nährstoffe langsam und kontrolliert abgibt. Mikrogele sind winzige Partikel aus quervernetzen Makromolekülen, die Wasser und andere Moleküle wie Düngersubstanzen sehr effizient binden können.

Die Forscher um Ulrich Schwaneberg, Felix Jakob und Andrij Pich statteten die Gelpartikel im Inneren mit Bindestellen aus, die Eisen-bindenden Proteinen von Bakterien nachempfunden wurden. Sie sorgen dafür, dass Eisenionen nur langsam abgegeben werden. Die Mikrogele werden bei pH 3 mit eisenhaltiger Lösung beladen. Bei Erhöhung des pH-Wertes auf 7 schrumpfen sie unter Wasserabgabe und binden dabei das Eisen.

Die Oberfläche der Gelpartikel wurde mit Ankerpeptiden aus Milchsäurebakterien bestückt, die fest an Blattoberflächen haften und so ein Auswaschen verhindern. Da das Gel Wasser enthält, bildet sich eine wässrige Mikroumgebung, in der das Eisen in die Blätter diffundieren kann. Gelb gewordene Blätter unter Eisenmangel leidender Gurkenpflanzen wurden an Stellen, auf die der neuartige Blattdünger getropft wurde, rasch wieder grün.

Durch Ausstattung mit anderen Bindestellen könnten die „Mikrogel-Container“ mit einer Vielzahl an Metallionen oder Wirkstoffen beladen werden. Eine kontrollierte und bedarfsgerechte Freisetzung von Wirkstoffen, minimiert die benötigten Einsatzmengen und den Eintrag von Dünger und Pestiziden in die Umwelt. Dank geringer Produktionskosten, hoher Beladung, einfacher Handhabung sowie gezielt einstellbarer Adhäsionseigenschaften wäre ein breiter industrieller Einsatz denkbar. Ziel sind selbstregulierende Zufuhrsysteme für eine nachhaltige Landwirtschaft.

Richard A. Meurer et al, Biofunctional Microgel-Based Fertilizers for Controlled Foliar Delivery of Nutrients to Plants, Angewandte Chemie International Edition (2017). DOI: 10.1002/anie.201701620

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Herstellung von Bausteinen zur Synthese von Filtermembranen

Herstellung von Bausteinen zur Synthese von Filtermembranen Bio VI

Der Eisentransporter FhuA - Ferric hydroxamate uptake protein component A, ein Kanalprotein aus dem Bakterium Escherichia coli, wurde maßgeschneidert verändert für die Herstellung von synthetischen Membranen, die aus FhuA-Proteinen und Polymeren bestehen. Das Protein bildet einen durchlässigen Kanal mit einer einheitlichen Porengröße von 2,5 bis 3,0 nm und einer fassförmigen Struktur. Für die Anbindung von PNIPAAm-Polymerketten wurden Lysinreste an spezifischen Positionen ringförmig außerhalb vom Kanal oberhalb der Transmembranregion angeordnet. Dieses Design ermöglicht das Wachsen lassen von Polymerketten ausgehend vom äußeren FhuA-Kanal. Die hergestellten Bausteine aus FhuA-Kanalprotein und Polymerketten werden zukünftig verwendet hybride Membranen für die Nanofiltration zu synthetisieren. In diesem Verfahren können diese Membranen als molekulares Sieb zur Trennung verschiedener Moleküle verwendet werden, was in den Downstream-Prozessen zur Herstellung von Süßungsmitteln, Pestiziden und Medikamenten essentiell ist.

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In vitro flow cytometry-basiertes Durchmusterungssystem für Cellulase engineering

In vitro flow cytometry-based screening platform for cellulase engineering Bio VI

Screeningtechnologie ist von entscheidender Bedeutung, wenn Biokatalysatoren durch gerichtete Evolution verbessert werden sollen, denn bei jedem einzelnen Versuch entstehen gegebenenfalls Millionen von Varianten dieser Katalysatoren. Damit aber solche Versuche dennoch in vertretbaren Zeiträumen durchgeführt werden können, wurden Ultrahochdurchsatz-Screeningmethoden entwickelt. Solche Techniken sind in der Lage bis zu 107 Einzelreaktionen pro Stunde zu analysieren und können daher die Mutagenese einer kompletten Peptidsequenz eines Enzyms mit hoher Kosten- und Zeiteffizienz untersuchen.

Diese Technologie wird umso schlagkräftiger, wenn sie mit zellfreier Expression gekoppelt wird. Diese Expressionsmethode ermöglicht es dem Experimentator den Diversitätsverlust während der Transformation von Mutationsbibliotheken in die Expressionswirte zu reduzieren, sondern auch die Modifikation von Enzymen menschlichen und tierischen Ursprungs oder die direkte Evolution von Enzymen, die toxisch für die Expressionswirte sind.

Die erste funktionstüchtige Kombination aus zellfreier kompartimentalisierter Expression mit Hochdruchsatz-Screening wurde in der InVitroFlow-Technologie realisiert und bereits erfolgreich auf die gerichtete Evolution von Cellulase-Enzymen angewandt.

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Durchmusterung einer Promoter Toolbox zur Erhöhung der Proteinproduktion in Escherichia coli

Screening through the PLICable promoter toolbox enhances protein production in Escherichia coli Bio VI

Escherichia coli ist ein häufig verwendeter Organismus für die rekombinante Proteinproduktion. Die Produktkonzentration ist hängt allerdings stark vom verwendetedn Expressionssystem ab. Promotoren sind deshalb ein Schlüsselelement für die Kontrolle des Expressionslevels. Diese Studie beschreibt die Entwicklung einer neuartigen „PLICbaren“ Promotoren „Werkzeugkiste“, die es ermöglicht, in nur einem Klonierungsschritt und nach einem Screening-Versuch den am besten geeigneten Promotor aus einer Auswahl aus zehn IPTG induzierbaren Promotoren (T7, A3, lpp, tac, pac, Sp6, lac, npr, trc und syn) zu identifizieren und somit Proteinproduktion in hohen Konzentrationen erlaubt.

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