Forschungshighlights

 
 

Eine Schleifen-Engineering-Strategie verbessert die Aktivität der Laccase lcc2 in ionischen Flüssigkeiten und wässrigen Lösungen

Photo von Anne Wallraf Bio VI

A. M. Wallraf, H. Liu, L. Zhu, G. Khalfallaha, C. Simons, H. Alibiglou, M. D. Davari and U. Schwaneberg, Green Chemistry, 2018, DOI: 10.1039/C7GC03776G

 
 

Es konnte eine Domänenverbindungsschleife innerhalb der Laccase identifiziert werden, die für die Enzymaktivität in ionischen Flüssigkeiten von großer Bedeutung ist.

Laccasen sind am Ligninabbau beteiligt. Mit EMI- und BMIM-basierten ionischen Flüssigkeiten kann Holzbiomasse effizient verflüssigt werden, während gleichzeitig aber die Laccaseaktivität durch die ionischen Flüssigkeiten drastisch reduziert wird. Ein vielversprechender Ansatz zur Verbesserung der Aktivität und Resistenz von Laccasen in ionischen Flüssigkeiten ist das Protein Engineering, durch das die Ligninvalorisierung für die nachhaltige Produktion von Kraftstoffen und hochwertigen Bulk-Chemikalien effizienter gestaltet werden kann. Wir berichten erstmals über ein effizientes semi-rationales Design mit Fokus auf eine Domänenverbindungsschleife der Laccase lcc2 (Schleife L1) aus der Schmetterlings-Tramete Trametes versicolor.

Die Strategie des Schleifen-Engineerings basiert auf einer KnowVolution-Kampagne und kann in drei Schritte unterteilt werden. Die Vorhersage von sieben resistenzsteigernden Positionen der 37 Aminosäuren in L1 (Reste 284-320) wurde mittels in silico SSM-Analyse mit FoldX durchgeführt. Diese sieben Positionen wurden zunächst einzeln gesättigt. Daraufhin wurden vier der sieben vorteilhaften Positionen gleichzeitig unter Verwendung von OmniChange mithilfe gerichteter Mutagenese gesättigt. Die OmniChange-Varianten OM1 (A285P / A310R / A312E / A318G) und OM3 (A310D / A312P / A318R) zeigten eine um 3,9fache (535,8 ± 36,9 U / mg) bzw. 1,6-fach (216,8 ± 5,3 U / mg) erhöhte spezifische Aktivität in wässriger Lösung (lcc2 WT, 138,9 ± 6,5 U / mg) bzw. bis zu 8,4-fach erhöhte Aktivität in (35% (v / v)) EMIM EtSO4 und wässrige Lösung im Vergleich zu lcc2 WT. Die computergestützte Analyse des Wasserstoffbindungsmusters zeigte, dass beide Varianten eine erhöhte Anzahl von Wasserstoffbrücken innerhalb der Schleife und zwischen den Domänen zwei und drei aufwiesen, was zu einer erhöhten Resistenz gegenüber ionischen Flüssigkeiten führte.

 
  Schema des Loop Engineering - Versuches Royal Society of Chemistry
 
 

Eine Entropieanalyse zeigte, dass die Substitution von Alanin an jeder ausgewählten Aminosäureposition A285, A310, A312 und A318 die Flexibilität der Schleife L1 reduziert. Die Analyse mit dem ConSurf-Server zeigte, dass die lange Domänenverbindungsschleife L1 ein konserviertes Merkmal in pilzlichen Laccasen ist, was das Schleifen-Engineering als nützliche Strategie zum Erhöhen der Laccase-Aktivität in ionischen Flüssigkeiten und wässrigen Lösungen nahelegt. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft - DFG - im Rahmen des Forschungsclusters "Maßgeschneiderte Kraftstoffe aus Biomasse" gefördert.

 
 

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Hohlraumvolumen-Engineering eines Beta-Fassproteins generiert effiziente Biohybridkatalysatoren für Olefinmetathese

Photo von Alexander Grimm und Daniel Sauer Bio VI

Grimm, A.R.*, Sauer, D.F.*, Davari, M.D., Zhu, L., Bocola, M., Kato, S., Onoda, A., Hayashi, T., Okuda, J., Schwaneberg, U.; ACS Catalysis, 2018, 8, pp 3358–3364, DOI: 10.1021/acscatal.7b03652. (*gleichermaßen beigetragen)

 

Die erfolgreiche Anwendung der präsentierten Hohlraumvolumen-Engineering Strategie auf die Biohybridkatalyse kann potentiell auf weitere Beta-Fassproteine übertragen werden um Hohlraumvolumina zu generieren die zu den sterischen Anforderungen von synthetischen Katalysatoren passen.

 
  Biohybridkatalysator Bio VI

Wenn man einen synthetischen Metallkatalysator in ein Proteingerüst einbaut, erhält man einen Biohybridkatalysator. Das Proteingerüst kann die Selektivität des Metallkatalysators potentiell verändern und macht es in Wasser löslich, ohne dessen breites Substratspektrum zu verlieren. Was an der Arbeit in dieser Publikation neu ist, ist das Proteingerüste für synthetische Katalysatoren bis jetzt hauptsächlich dadurch angepasst worden sind, dass einzelne Aminosäuren ausgetauscht wurden. Obwohl mit dieser konventiellen Strategie bisher viel erreicht wurde, wird sie durch die Anzahl an Aminosäuren im Protein begrenzt, die zum Austausch zur Verfügung stehen. In dieser Arbeit wurde Hohlraumvolumen-Engineering eines Beta-Fassproteins namens Nitrobindin betrieben, indem mehrere Beta-Stränge dupliziert wurden, um eine vergrößerte Variante zu generieren.

 
 

"Das Einbringen eines synthetischen Metallkatalysators in ein Proteingerüst ergibt einen Biohybridkatalysator, der Löslichkeit in Wasser mit dem breiten Reaktionsspektrum von organometallischen Katalysatoren vereint."

Alexander R. Grimm

Indem ganze Beta-Stränge dupliziert wurden, war es möglich große Katalysatoren kovalent einzubauen und exzellente Umsätze in einer ganzen Reihe an Olefinmetathesereaktionen – Kohlenstoff-Kohlenstoff Doppelbindungsausbildungsreaktionen – zu erzielen. Was daran so spannend ist, ist das die angewendete Designstrategie potentiell auf weitere Beta-Fassproteingerüste übertragen werden kann um Hohlraumvolumina zu generieren die zu den sterischen Anforderungen von synthetischen Katalysatoren passen. Wenn Hochdurchsatzdurchmusterung in Zukunft auf diese neuen Varianten angewendet wird, sollte es möglich sein gelenkte Biohybridkatalysatorevolution viel effizienter zu erforschen. Dies wird die synthetische Leistung wahrscheinlich noch weiter steigern. Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung der Deutschen Forschungsgemeinschaft und das Bundesministerium für Bildung und Forschung ermöglicht.

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  Biohybridkatalysator ACS Catalysis Abbildung 1 Umsatz von generiertem Biohybridkatalysator nach Hohlraumvolumen-Engineering und proteinfreiem Katalysator in ringöffnender metathetischen Polymerisation
 
 

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Eine E.coli-Ganzzellplattform für künstliche Metalloenzyme: Polyphenylacetylen-Produktion mittels eines Rhodium-Nitrobindin-Metallproteins

Photo von Alexander Grimm Bio VI

Grimm, A.R., Sauer, D.F., Polen, T., Zhu, L., Hayashi T., Okuda J., Schwaneberg, U. (2018). A whole cell E. coli display platform for artificial metalloenzymes: polyphenylacetylene production with a rhodium-nitrobindin metalloprotein. ACS Catal., 8, 2611-2613.

 
 

Eine Ganzzell E. coli Displayplattform für artifizielle Metalloenzyme

 
  Funktionsweise des Ganzzellkatalysators Bio VI

In dieser Publikation unserer Kollegen aus der Abteilung Hybridkatalyse und Hochdurchsatz-Durchmusterungssysteme wurde der erste bakterielle zelloberflächendisplaybasierte Ganzzellbiohybridkatalysator generiert, charakterisiert und für die stereoselektive Polymerisation von Phenylacetylen angewendet. Ganzzellkatalyse ist für die kosteneffektive Produktion von Chemikalien mit biotechnologischen Mitteln sehr wichtig. Trotz der vielversprechenden Verwendung von ganzen Zellen für die Biohybridkatalyse, mussten Wissenschaftler bis dato feststellen, dass in ihren Experimenten wertvolle synthetische Metallkatalysatoren

 
 

in Zellen durch intrazelluläre Thiole inaktiviert wurden. Die Autoren haben die Oberfläche von Escherichia coli Zellen deshalb mithilfe eines esterasebasierten Autotransporters mit Rhodium-Nitrobindin Biohybridkatalysatoren aufgerüstet, um die Katalysatoren von inhibierenden intrazellulären Verbindungen zu trennen. Eine hohe Anzahl von 39.000.000 Umsätzen pro Zelle in der Polymerisation von Phenylacetylen und potentielle Anwendungen in der gelenkten Evolution und Hochdurchsatzdurchmusterung machen die vorgestellte Technologie zu einer attraktiven Plattform für bioorthonogale Reaktionen. Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft und das Bundesministerium für Bildung und Forschung möglich gemacht.

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  Funktionsprinzip Ganzzellkatalysator Bio VI
 
 

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Ein enzymatischer Weg zu α-Tocopherol Synthonen: Aromatische Hydroxylierung von Pseudocumol und Mesitylen mittels P450 BM3

A.Denning/A.Weingartner Bio VI

Dennig*, A., Weingartner*, A. M., Kardashliev, T., Müller, C. A., Tassano, E., Schürmann, M., Ruff, A. J., Schwaneberg, U. (2017). Chemistry - European Journal , first published online: October 9 2017, DOI: 10.1002/chem.201703647

 
 

P450 BM3 Varianten für die Produktion von phenolischen Schlüsselbausteinen für die α-Tocopherol-Synthese

 
  Hydroxylierung durch P450 BM§ Wiley VCH

Vitamin E findet vielfältige Anwendung, wie zum Bespiel in Kosmetika, in der Lebensmittelindustrie und als Nahrungsergänzungsmittel. Aufgrund des wachsenden Bedarfes sind alternative Wege zur Herstellung von Vitamin E von industriellem Interesse. Mit unserer Arbeit zeigen wir die erste direkte aromatische Hydroxylierung von Pseudocumol und Mesitylen in Wasser, unter Luftsauerstoff und milden Reaktionsbedingungen für die Gewinnung von aromatischen Ausgangsbausteine für die Synthese von Vitamin E. Einer der wichtigsten, aromatischen Bausteine hierfür ist Trimethylhydroquinon - TMHQ. Die beschriebene P450 BM3 Variante M3 ist in der Lage TMHQ direkt von Pseudocumol ausgehend zu produzieren, was eine neue und umweltfreundlichere Vitamin E Synthese ermöglicht. Im Falle von Mesitylen kann eine P450 BM3 katalysierte Oxidation zur Herstellung von nützlichen Bausteinen beitragen, welche wiederum als Ausgangsstoff für die TMHQ Erzeugung genutzt werden können. Zusammenfassend beschreibt die Studie einen ersten enzymatischen Weg für die Herstellung von aromatischen Ausgangsbausteinen für die Vitamin E Synthese und erste katalytische und mechanistische Untersuchungen der direkten aromatischen Hydroxylierung von Trimethylbenzenen mit Luftsauerstoff.

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Umkehrung der Enantiopräferenz von cpADH5 und Veränderung der Kettenlängenspezifität für Methyl-3-Hydroxyalkanoate

Yunus Ensari & Gaurao Dhoke Bio VI

Yunus Ensari, Gaurao V. Dhoke, Mehdi D. Davari, Marco Bocola, Anna Joëlle Ruff, Ulrich Schwaneberg, Chemistry – A European Journal 2017, 23, 51, Issue, 12636-12645.

 
 

Die Vergrößerung der Substratbindetasche von cpADH5 führte zur Umsetzung von Methyl-3-Hydroxyalkanoaten mittlerer Kettenlänge und Umkehrung der Enantiomerpräferenz.

 
  cpADH5 Chemistry – A European Journal Schema 1: Allgemeiner Überblick über das Engineering der Bindetasche von cpADH5

Die selektive Oxidation von primären oder sekundären Alkoholen zu Carbonyl-Verbindungen, z.B. Aldehyden und Ketonen, ist eine Schlüsselreaktion in der organischen Synthese und in der Industrie. Die Oxidation von Alkoholen zu Ketonen kann mit einer Vielzahl von chemischen Oxidationsmethoden effizient durchgeführt werden. Jedoch stellen Selektivität, die Produktion ungewünschter Nebenprodukte, Substratspektrum und Umsetzungsraten bei der Oxidation von Alkoholen immer noch eine große Herausforderung dar. Alkoholdehydrogenasen sind vielversprechende Alternativen zu Metallkatalysatoren und katalysieren reversible Oxidationen von primären und sekundären Alkoholen zu deren korrespondierenden Aldehyden oder Ketonen.

Wir hoffen, dass die enzymatische Oxidation von 3-Hydroxy-FAMEs neuartige Synthesewege hin zu attraktiven Bausteinen für die Synthese von Pheromonen und Beta-Lactam-Antibiotika ermöglicht.

Gaurao V. Dhoke

Keton-funktionalisierte Fettsäurederivate sind vielseitige Verbindungen in der organischen Chemie, die als Intermediate und Bausteine in der Herstellung von u.a. pharmazeutischen Wirkstoffen und Detergentien genutzt werden.

Diese Studie stellt die erste durch Protein Engineering überarbeitete Candida parapsilosis Alkoholdeydrogenase - cpADH5 - vor, die Methyl 3-hydroxyhexanoat und Methyl 3-hydroxyoktanoat zu ihren entsprechenden Ketonen effizient oxidieren kann. Diese Reaktionen können durch den Wildtyp von cpADH5 nicht katalysiert werden. In dieser Studie wurde die Substratbindetasche von cpADH5 mutiert und neu designt, um ihr Substratspektrum auf 3-Hydroxy-Fettsäuremethylester – FAME – mit mittleren Kettenlängen von 6 bis 12 Kohlenstoffatomen auszudehnen. Des weiteren beschreiben wir die invertierte Enantiopräferenz der von uns genenerierten cpADH5 Variante für die Oxidation von Methyl-3-Hydroxybutyrat.

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Mikro-Lieferservice für Dünger

Mikro-Lieferservice für Dünger Wiley-VCH

Pflanzen können Dünger nicht nur über die Wurzeln, sondern auch über die Blätter aufnehmen. Über einen längeren Zeitraum gestaltet sich eine Blattdüngung jedoch schwierig. Deutsche Forscher stellen jetzt in der Zeitschrift Angewandte Chemie ein leistungsfähiges Zufuhrsystem für Mikronährstoffe auf Basis biohybrider Mikrogele vor. Spezielle Peptide verankern die „Mikrocontainer“ fest auf der Blattoberfläche, während Bindestellen im Inneren für eine verzögerte Abgabe der „Ladung“ sorgen.

Die Blattdüngung ist bereits Praxis, z.B. im Weinbau, wenn Reben aufgrund eines Mineralmangels gelbe Blätter bekommen. Trotz Verwendung von Detergenzien, Adhäsiven und Befeuchtungsmitteln ist eine kontrollierte Nährstoffzufuhr über mehrere Wochen per Blattdüngung aber kaum zu erreichen. Bis zu 80% der Nährstoffe werden abgewaschen, gelangen in den Boden und werden zum Großteil in Formen umgewandelt, die die Pflanze nicht nutzen kann. Zudem können sie in Gewässer gespült werden und Umweltprobleme verursachen. Ein weiteres Problem: Bei starker Sonneneinstrahlung verdunstet das Wasser der aufgetragenen Düngerlösung. Die entstehende hohe Salzkonzentration entzieht dem Blatt Wasser, was zu Verbrennungsschäden führen kann.

Das Team vom DWI-Leibniz-Institut für Interaktive Materialien, Aachen, der RWTH Aachen und der Universität Bonn hat jetzt ein Blattdünger-System auf Basis biokompatibler Mikrogele entwickelt, das lange und selektiv an Blättern haftet und Nährstoffe langsam und kontrolliert abgibt. Mikrogele sind winzige Partikel aus quervernetzen Makromolekülen, die Wasser und andere Moleküle wie Düngersubstanzen sehr effizient binden können.

Die Forscher um Ulrich Schwaneberg, Felix Jakob und Andrij Pich statteten die Gelpartikel im Inneren mit Bindestellen aus, die Eisen-bindenden Proteinen von Bakterien nachempfunden wurden. Sie sorgen dafür, dass Eisenionen nur langsam abgegeben werden. Die Mikrogele werden bei pH 3 mit eisenhaltiger Lösung beladen. Bei Erhöhung des pH-Wertes auf 7 schrumpfen sie unter Wasserabgabe und binden dabei das Eisen.

Die Oberfläche der Gelpartikel wurde mit Ankerpeptiden aus Milchsäurebakterien bestückt, die fest an Blattoberflächen haften und so ein Auswaschen verhindern. Da das Gel Wasser enthält, bildet sich eine wässrige Mikroumgebung, in der das Eisen in die Blätter diffundieren kann. Gelb gewordene Blätter unter Eisenmangel leidender Gurkenpflanzen wurden an Stellen, auf die der neuartige Blattdünger getropft wurde, rasch wieder grün.

Durch Ausstattung mit anderen Bindestellen könnten die „Mikrogel-Container“ mit einer Vielzahl an Metallionen oder Wirkstoffen beladen werden. Eine kontrollierte und bedarfsgerechte Freisetzung von Wirkstoffen, minimiert die benötigten Einsatzmengen und den Eintrag von Dünger und Pestiziden in die Umwelt. Dank geringer Produktionskosten, hoher Beladung, einfacher Handhabung sowie gezielt einstellbarer Adhäsionseigenschaften wäre ein breiter industrieller Einsatz denkbar. Ziel sind selbstregulierende Zufuhrsysteme für eine nachhaltige Landwirtschaft.

Richard A. Meurer et al, Biofunctional Microgel-Based Fertilizers for Controlled Foliar Delivery of Nutrients to Plants, Angewandte Chemie International Edition (2017). DOI: 10.1002/anie.201701620

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Herstellung von Bausteinen zur Synthese von Filtermembranen

Herstellung von Bausteinen zur Synthese von Filtermembranen Bio VI

Der Eisentransporter FhuA - Ferric hydroxamate uptake protein component A, ein Kanalprotein aus dem Bakterium Escherichia coli, wurde maßgeschneidert verändert für die Herstellung von synthetischen Membranen, die aus FhuA-Proteinen und Polymeren bestehen. Das Protein bildet einen durchlässigen Kanal mit einer einheitlichen Porengröße von 2,5 bis 3,0 nm und einer fassförmigen Struktur. Für die Anbindung von PNIPAAm-Polymerketten wurden Lysinreste an spezifischen Positionen ringförmig außerhalb vom Kanal oberhalb der Transmembranregion angeordnet. Dieses Design ermöglicht das Wachsen lassen von Polymerketten ausgehend vom äußeren FhuA-Kanal. Die hergestellten Bausteine aus FhuA-Kanalprotein und Polymerketten werden zukünftig verwendet hybride Membranen für die Nanofiltration zu synthetisieren. In diesem Verfahren können diese Membranen als molekulares Sieb zur Trennung verschiedener Moleküle verwendet werden, was in den Downstream-Prozessen zur Herstellung von Süßungsmitteln, Pestiziden und Medikamenten essentiell ist.

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In vitro flow cytometry-basiertes Durchmusterungssystem für Cellulase engineering

In vitro flow cytometry-based screening platform for cellulase engineering Bio VI

Screeningtechnologie ist von entscheidender Bedeutung, wenn Biokatalysatoren durch gerichtete Evolution verbessert werden sollen, denn bei jedem einzelnen Versuch entstehen gegebenenfalls Millionen von Varianten dieser Katalysatoren. Damit aber solche Versuche dennoch in vertretbaren Zeiträumen durchgeführt werden können, wurden Ultrahochdurchsatz-Screeningmethoden entwickelt. Solche Techniken sind in der Lage bis zu 107 Einzelreaktionen pro Stunde zu analysieren und können daher die Mutagenese einer kompletten Peptidsequenz eines Enzyms mit hoher Kosten- und Zeiteffizienz untersuchen.

Diese Technologie wird umso schlagkräftiger, wenn sie mit zellfreier Expression gekoppelt wird. Diese Expressionsmethode ermöglicht es dem Experimentator den Diversitätsverlust während der Transformation von Mutationsbibliotheken in die Expressionswirte zu reduzieren, sondern auch die Modifikation von Enzymen menschlichen und tierischen Ursprungs oder die direkte Evolution von Enzymen, die toxisch für die Expressionswirte sind.

Die erste funktionstüchtige Kombination aus zellfreier kompartimentalisierter Expression mit Hochdruchsatz-Screening wurde in der InVitroFlow-Technologie realisiert und bereits erfolgreich auf die gerichtete Evolution von Cellulase-Enzymen angewandt.

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Durchmusterung einer Promoter Toolbox zur Erhöhung der Proteinproduktion in Escherichia coli

Screening through the PLICable promoter toolbox enhances protein production in Escherichia coli Bio VI

Escherichia coli ist ein häufig verwendeter Organismus für die rekombinante Proteinproduktion. Die Produktkonzentration ist hängt allerdings stark vom verwendetedn Expressionssystem ab. Promotoren sind deshalb ein Schlüsselelement für die Kontrolle des Expressionslevels. Diese Studie beschreibt die Entwicklung einer neuartigen „PLICbaren“ Promotoren „Werkzeugkiste“, die es ermöglicht, in nur einem Klonierungsschritt und nach einem Screening-Versuch den am besten geeigneten Promotor aus einer Auswahl aus zehn IPTG induzierbaren Promotoren (T7, A3, lpp, tac, pac, Sp6, lac, npr, trc und syn) zu identifizieren und somit Proteinproduktion in hohen Konzentrationen erlaubt.

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