Hybridkatalyse & Hochdurchsatz-Durchmusterungssysteme

  Ein Biohybridkatalysator Urheberrecht: Bio VI

Die Abteilung Hybridkatalyse und Hochdurchsatzdurchmusterungssysteme hat sich zum Ziel gesetzt die Felder der Hybridkatalysatoren und Hochdurchsatzdurchmusterungmethoden maßgeblich voranzubringen, indem sie die Expertisen in beiden Feldern kombiniert, um Hybridkatalysatoren zu evolvieren. Hybridkatalysatoren sind Metallkatalysatoren, die in eine Proteinumgebung eingebettet werden und die Synthesewelt der Biokatalyse (einzigartige Reaktionskontrolle durch die spezifische Positionierung der Substrate im Protein) und der Metallkatalysatoren vereint. Die hergestellten Hybridkatalysatoren können synthetisch wichtige Reaktionen katalysieren, die „in natürlich vorkommenden Enzymen unbekannt“ sind (z.B. Metathesereaktionen; Nobelpreis für Chemie 2005) 1-3. Die Metallkatalysatoren werden dabei von unseren Kooperationspartnern Prof. Okuda und Prof. Herres-Pawlis an der RWTH Aachen sowie Prof. Hayashi und Prof. Onoda an der Osaka University synthetisiert.

 
  Nitrobindin-Rhodium-Hybridkatalysator Urheberrecht: Bio VI

Zu den bislang größten Erfolgen der Abteilung gehört unter anderem das Protein Engineering zweier β-Fass-Proteine (FhuA: großer Querschnitt, Durchmesser 3,9 – 4,6 nm; Nitrobindin: kleiner Querschnitt) die Rh- und Ru-Metallkatalysatoren effizient aufnehmen können und dadurch z.B. alle Arten von Metathesereaktionen katalysieren können1-3. Durch Protein Engineering konnte darüber hinaus die Enantiopräferenz von katalysierten Reaktionen umgekehrt werden4-5. Durch Erweiterung des Querschnitts von β-Fassproteinen mittels Aminosäureaustauschen und dem Anfügen von β-Strängen wurden effizientere Hybridkatalysatoren generiert. Zusätzlich wurde ein erstes Konzept für kostengünstigere Ganzzell-Hybridkatalysatoren entwickelt.

 
  Prinzip Fur-Shell Urheberrecht: Bio VI Das Prinzip der "Fur Shell"-Methode

Ein weiteres Highlight der Abteilung war die Entwicklung einer Hochdurchsatzdurchmusterungsplattform auf Basis von Durchflusszytometrie für Hydrolasen (Lipase, Cellulase, Esterase, Phytase), die es ermöglicht Millionen von Enzymvarianten pro Stunde zu durchmustern. Mit Durchmusterung mittels der „Fur-Shell“-Methode ergab schon in einer einzelnen Evolutionsrunde 14fach aktivitätsverbesserte Enzyme (wesentlich mehr als die durchschnittlich 1,5 – 2,5fach verbesserte Enzymaktivität, die mit herkömmlichen Methoden erzielt werden). Das Fur-Shell-Prinzip nutzt gekoppelte enzymatische Polymerisationsreaktionen (Polyesterbildung mit einem copolymerisierten Fluoreszenzfarbstoff). In Anwesenheit einer aktiven Hydrolasevariante wird Glukose produziert, die von einer Glukoseoxidase zu Wasserstoffperoxid umgesetzt wird, um in Anwesenheit von Fe2+ eine fluoreszierende Hydrogelschicht auf der Oberfläche von E. coli-Zellen zu bilden.

 
  AFM-Bild von Fur-Shell auf E.coli Urheberrecht: Bio VI AFM-Aufnahme von mit Polymer überzogener E. coli-Zelle.

Die in der Abteilung Hybridkatalyse & Hochdurchsatzdurchmusterungsysteme entwickelten Strategien unterstützen die Kernkompetenz des Instituts durch Methodenentwicklung für die Gelenkte Evolution (z.B. ermöglicht diese die effiziente Durchmusterung von OmniChange- oder Zufallsmutagenese-Bibliotheken), indem beispielsweise eine höhere Anzahl an vorteilhaften Aminosäurepositionen aufgefunden werden, die Enzymeigenschaften verbessern, und hierzu stärkere Verbesserungen pro Gelenkter Evolutionrunde liefern.

 
 

1. Sauer, D. F., Himiyama, T., Tachikawa, K., Fukumoto, K., Onoda, A., Mizohata, E., Inoue, T., Bocola, M., Schwaneberg, U., Hayashi, T., Okuda, J. (2015). A Highly Active Biohybrid Catalyst for Olefin Metathesis in Water: Impact of a Hydrophobic Cavity in a β-Barrel Protein. ACS Catal., 2015, 5, 7519-7522.

2. Sauer, D. F., Bocola, M., Broglia, C., Arlt, M., Zhu, L., Brocker, M., Schwaneberg, U., Okuda, J. (2015). Hybrid ruthenium ROMP catalysts based on an engineered variant of β-barrel protein FhuA ΔCVFtev: effect of spacer length. Chem. Asian J., 10, 177-182.

3. Philippart, F., Arlt, M., Gotzen, S., Tenne, J., Bocola, M., Chen, H.H., Zhu, L., Schwaneberg, U., Okuda, J. (2013). A Hybrid Ring-Opening Metathesis Polymerization Catalyst Based on an Engineered Variant of the β-Barrel Protein FhuA. Chemistry, 19, 41, 13865-13871.

4. Fukumoto, K., Onoda, A., Mizohata, E., Bocola, M., Inoue, T., Schwaneberg, U., Hayashi, T. (2014). Rhodium-Complex-Linked Hybrid Biocatalyst: Stereo-Controlled Phenylacetylene Polymerization within an Engineered Protein Cavity. ChemCatChem, 6, 1229-1235.

5. Onoda, A., Fukumoto, K., Arlt, M., Bocola, M., Schwaneberg, U., Hayashi, T. (2012). A rhodium complex-linked β-barrel protein as a hybrid biocatalyst for phenylacetylene polymerization. Chem. Commun., 48, 9756-9758.

6. Körfer, G., Pitzler, C., Vojcic, L., Martinez, R., Schwaneberg, U. (2016). In vitro flow cytometry-based screening platform for cellulase engineering. Scientific Reports, 6, 1-12.

7. Lülsdorf*, N., Pitzler*, C., Biggel, M., Martinez, R., Vojcic, L., Schwaneberg, U. (2015). A flow cytometer-based whole cell screening toolbox for directed hydrolase evolution through fluorescent hydrogels. Chem. Commun., 51, 8679-8682.

8. Pitzler, C., Wirtz, G., Vojcic, L., Hiltl S., Böker, A., Martinez, R., Schwaneberg, U. (2014). A Fluorescent Hydrogel-based Flow Cytometry High-Throughput Screening Platform for Hydrolytic Enzymes. Chemistry & Biology, 21, 1733-1742.