Publikations-Highlights

 

Ein enzymatischer Weg zu α-Tocopherol Synthonen: Aromatische Hydroxylierung von Pseudocumol und Mesitylen mittels P450 BM3

A.Denning/A.Weingartner Urheberrecht: Bio VI

Dennig*, A., Weingartner*, A. M., Kardashliev, T., Müller, C. A., Tassano, E., Schürmann, M., Ruff, A. J., Schwaneberg, U. (2017). Chemistry - European Journal , first published online: October 9 2017, DOI: 10.1002/chem.201703647

 
 

P450 BM3 Varianten für die Produktion von phenolischen Schlüsselbausteinen für die α-Tocopherol-Synthese

 
  Hydroxylierung durch P450 BM§ Urheberrecht: Wiley VCH

Vitamin E findet vielfältige Anwendung, wie zum Bespiel in Kosmetika, in der Lebensmittelindustrie und als Nahrungsergänzungsmittel. Aufgrund des wachsenden Bedarfes sind alternative Wege zur Herstellung von Vitamin E von industriellem Interesse. Mit unserer Arbeit zeigen wir die erste direkte aromatische Hydroxylierung von Pseudocumol und Mesitylen in Wasser, unter Luftsauerstoff und milden Reaktionsbedingungen für die Gewinnung von aromatischen Ausgangsbausteine für die Synthese von Vitamin E. Einer der wichtigsten, aromatischen Bausteine hierfür ist Trimethylhydroquinon - TMHQ. Die beschriebene P450 BM3 Variante M3 ist in der Lage TMHQ direkt von Pseudocumol ausgehend zu produzieren, was eine neue und umweltfreundlichere Vitamin E Synthese ermöglicht. Im Falle von Mesitylen kann eine P450 BM3 katalysierte Oxidation zur Herstellung von nützlichen Bausteinen beitragen, welche wiederum als Ausgangsstoff für die TMHQ Erzeugung genutzt werden können. Zusammenfassend beschreibt die Studie einen ersten enzymatischen Weg für die Herstellung von aromatischen Ausgangsbausteinen für die Vitamin E Synthese und erste katalytische und mechanistische Untersuchungen der direkten aromatischen Hydroxylierung von Trimethylbenzenen mit Luftsauerstoff.

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Ruff*, A.J., Arlt*, M. van Ohlen, M., Kardashliev, T., Dennig, A., Konarzycka-Bessler, M., Bocola, M., , Urlacher**, V.B., and Schwaneberg**, U. 2016. An engineered outer membrane pore enables an efficient oxygenation of aromatics and terpenes.

J. Mol. Catal. B: Enzymatic, 134, 285-294.

Biocatalysis with cytochrome P450 enzymes are important for the industrial production of fine chemicals, pharmaceuticals, fragrance and flavor compounds since chemoselective hydroxylation of aromatics and terpenes are chemically difficult to achieve. A few P450 based industrial processes have been developed based on whole cell catalysis. However, the outer membrane of microbial cells forms an effective barrier, which reduces the uptake of hydrophobic substrates. The coexpression of outer membrane proteins in E. coli such as the ferric hydroxamate uptake protein named FhuA can provide alternative solutions to chemical or physical methods for increasing compound flux through the outer membrane of E. coli and thereby to boost productivities. In this study we employed an engineered FhuA Δ1-160 variant in which the “cork domain” was removed (first 160 residues are deleted); FhuA Δ1-160 has a cross-section of 39–46 Å with a “free” inner diameter of about 14 Å that serves as passive diffusion channel. FhuA WT and Δ1-160 were coexpressed on a bicistronic system with two P450 BM3 variants for regiospecific hydroxylation of aromatic compounds toluene and anisole as well as for oxidation of two terpenes (α)-pinene and (R)-(+)-limonene. The presence of FhuA Δ1‐160 resulted in a doubled product concentration for toluene (35 μ to 50 μM), anisole (25 μM to 45 μM), pinene (12 μM to 20 μM) and limonene (12 μM to 25 μM) and five times higher for the coumarin derivative BCCE. In order to characterizes and compensate for expression variations a quantification method based on Chromeo546-labled StrepTactinII was developed to quantify the number of FhuA Δ1-160 in the outer E. coli membrane (∼44000 of FhuA Δ1-160 per cell). Morphology studies showed that a 6% E. coli surface coverage can be achieved with FhuA Δ1‐160 without significantly influencing the E. coli rod shape. In summary, FhuA Δ1-160 efficiently increases uptake of hydrophobic aromatics and terpenes for whole-cell biotransformations and can likely be used for other enzymes and/or substrates.

  Ganzzelkatalysator Urheberrecht: BioVI Whole cell catalyst coexpressing the outer membrane protein FhuA and P450 BM3
 
 

Müller*, C. A., Weingartner*, A. M., Dennig, A., Ruff, A. J., Gröger, H., Schwaneberg, U. 2016. A whole cell biocatalyst for double oxidation of cyclooctane.

J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 43, 1641-1646.

  Ganzzellkatalysator für die hydroxylierung von cyclooctane Urheberrecht: BioVI Doppelhydroxylierung von Cyclooctane zu Cyclooctanone

A novel whole cell cascade for double oxidation of cyclooctane to cyclooctanone was developed. The one-pot oxidation cascade requires only a minimum of reaction components: resting E. coli cells in aqueous buffered medium (=catalyst), the target substrate and oxygen as environmental friendly oxidant. Conversion of cyclooctane was catalysed with high efficiency (50% yield) and excellent selectivity (>94%) to cyclooctanone. The reported oxidation cascade represents a novel whole cell system for double oxidation of non-activated alkanes including an integrated cofactor regeneration. Notably, two alcohol dehydrogenases from Lactobacillus brevis and from Rhodococcus erythropolis with opposite cofactor selectivities and one monooxygenase P450 BM3 were produced in a coexpression system in one single host. The system represents the most efficient route with a TTN of up to 24363 being a promising process in terms of sustainability as well.

 
 

Ruff, A. J., Dennig, A., and Schwaneberg, U. 2013. To get what we aim for: progress in diversity generation methods.

FEBS J., 280, 2961-2978

In der Forschung als auch in der Industrie wird gelenkte Evolution zum Design von maßgeschneiderten Enzymen eingesetzt. Vielfaltsgenerierungsmethoden die zu gelenkten Evolution von Proteinen eingesetzt werden, können in drei Kategorien eingeteilt werden: a - Zielgerichtete bzw. ortsspezifische Mutagenese - bestimmte Positionen werden zufallsbedingt verändert; b - zufällige Mutagenese - Mutationen werden zufallsbedingt über das gesamte Gen eingeführt; c - Genrekomination - Gene unterschiedler Herkunft werden fragmentiert und miteinander rekombiniert. Jede Methode hat ihre Vorteile und Einschränkungen, die stark vom verwendeten Enzym und den gewünschten Eigenschaften abhängig sind. Im Review „To get what we aim for: progress in diversity generation methods” fassen wir Neuentwicklungen im Bereich Vielfaltsgenerierung seit 2009 zusammen und diskutieren diese im Kontext zu einander. Verbesserung werden in Bezug auf den aktuellen Stand der Technik im Bereich Vielfaltsgenerierung und Hochdurchsatz-Musterung, Robustheit und Einfachheit diskutiert.

 
 

Dennig, A., Lülsdorf, N., Liu, H., and Schwaneberg, U. 2013. Regioselective o-hydroxylation of monosubstituted benzenes by P450 BM3.

Angew. Chemie, 53, 8459-8462.

  Aromaten Hydroxylierung Urheberrecht: Bio VI Aromaten Hydroxylierung mit P450 BM3

Die Monooxygenase P450 BM3 Variante M2, R47S/Y51W/I401M, wurde auf die Hydroxylierungsaktivität und Regioselektivität von ausgewählten monosubstituierten Benzolen untersucht. Die direkte, aromatische Hydroxylierung der Benzole erfolgte mithilfe von Luftsauerstoff bei Raumtemperatur und in Wasser. Exzellente Selektivität >99% und Aktivität, sowie erhöhte Kupplungseffizienzen gegenüber dem Wildtyp konnte mit der Variante M2 erzielt werden.

 
 

Ruff, A. J., Dennig, A., Wirtz, G., Blanusa, M., and Schwaneberg, U. 2012. Flow cytometer-based high throughput screening system for accelerated directed evolution of P450 monooxygenases.

ACS Catalysis, 2, 2724-2728

  3-CCE Urheberrecht: Bio VI Umsetzung von BCCE mit P450 BM3

Durchfluss-Cytometer basierte Durchmusterungs-Systeme bieten die Möglichkeit der Hochdurchsatz-Durchmusterung HTS von Enzym-Varianten, welche durch gelenkte Evolution erzeugt wurden. In dieser Arbeit wird eine Durchfluss-Cytometer basierte ultra-HTS Plattform für P450 Monooxygenasen in einem Ganzzell-Ansatz beschrieben. Die Monooxygenase P450 BM3 ist in der Lage 7-
Benzoxy-3-carboxy-coumarin ethyl ester BCCE zu einem floureszierenden Coumarin-Derivat umzusetzen. Nach Durchmusterung von 1,25·109 Zellen wurde eine 7-fach erhöhte Aktivität durch eine Runde gelenkter Evolution identifiziert.

 
 

Belsare, K. D., Ruff, A. J., Martinez, R., Shivange, A. V., Mundhada, H., Holtmann, D., Schrader, J., Schwaneberg, U. 2014 . P-LinK: A method for generating multicomponent cytochrome P450 fusions with variable linker length.

Biotechniques, 57, 13-20.

Fusionsproteine sind Proteine, die durch die Kopplung mehrerer Proteine durch einen „Linkerpeptid“ entstehen. Da ihre Anwendung in vielen Prozessen vorteilhaft ist, ist die Konstruktion von Fusionsproteinen eine wichtige molekularbiologische Methode. Der Abstand zwischen den fusionierten Proteinen kann die Faltung und Aktivität des Konstruktes beeinflussen und ist somit essentiell für die Proteineffizienz. Aus diesem Grund ist es entscheidend die optimale Länge des Linkerpeptids zu finden. Jedoch ist das Identifizieren der optimalen Länge durch konventionelle Methoden ein langwieriger und zeitaufwendiger Prozess. Zu diesem Zweck wurde die neue Methode P-LinK, Protein fusion with variable linker insertion, etabliert. Diese ermöglicht eine schnelle Klonierung mehrerer Linkervarianten in einem einzigen Klonierungs- und Transformationsschritt. Die Validierung der Methode erfolgte durch die Fusion von P450cin Monooxygenase CinA an das Flavodoxin-Shuttle Protein CinC. Dabei war es möglich auf einfacher und zuverlässiger Weise die optimale Linkerlänge durch das Testen von 16 verschiedenen Varianten zu finden.

 
 

Müller, C. A., Akkapurathua, B., Winkler, T., Staudt, S., Hummel, W., Gröger, H., and Schwaneberg, U. 2013. In vitro double-oxidation of n-heptane with direct co-factor regeneration.

Adv. Syn. & Cat.,2013, 355, 1787 – 1798

Durch das Nutzen von one-pot Reaktionen in der Biokatalyse für chemische Bausteine ist die Aufreinigung von Intermediaten nicht notwendig und das downstream processing kann reduziert werden. In dieser Arbeit wird die erste Doppel-Oxidation von n-Heptan zur Produktion von chiralen Alkoholen und Heptanonen durch einen Ganzzell-Ansatz beschrieben. Durch Nutzen einer Operon-Fusion wird die Co-Expression der Monooxygenase P450 BM3 aus Bacillus megaterium und der Alkohol-Dehydrogenase RE-ADH aus Rhodococcus erythropolis ermöglicht. Eine verbesserte in situ Cofaktor-Regenerierung konnte durch die Kopplung an die Glucose-Oxidation in E. coli erreicht werden. Im Vergleich zu bisher erreichten Werten für in vitro Oxidations-Kaskaden konnte eine 3-fach erhöhte Produktbildung festgestellt werden. Der ee erreichte Werte von >99 % für S-3-Heptanol. Durch zusätzliche Co-Expression einer Alkohol-Dehydrogenase aus Lactobacillus brevis Lb-ADH im selben Wirt konnten alle Heptanol-Isomere erhalten werden. Die Co-Expression einer anderen ADH erlaubte das Nutzen beider Cofaktoren, NADH und NADPH, in der Wirtszelle.

 
 

Shivange, A., Serwe, A., Dennig, A., Roccatano, D., Haefner, S., Schwaneberg, U. 2012. Directed evolution of a highly active Yersinia mollaretii phytase.

Appl Microbiol Biotechnol, Vol. 95, No. 2, 405-418

  Phytase-Engineering Urheberrecht: Bio VI Temperatur resistente Phytase-Varianten

Der Nährwert von phytinsäurereichen Futtermitteln wie z. B. Getreide und Ölpresskuchen wird durch die Zugabe von Phytase für Monogastriern, z.B. Schweinen, verbessert. Phytasen spalten Phytinsäure, myo-Inositol-1,2,3,4,5,6-hexakis Dihydrogenphosphat, in myo-Inositol und anorganisches Phosphat. Durch die Supplementierung des Futtermittels mit Phytase wird das in der Nahrung enthaltende Phosphat zugänglich und die Bildung von Phytinsäure-Mineral-Komplexen, die einen antinutritiven Effekt haben, verhindert. In der Vergangenheit wurden Phytasen unterschiedlicher Herkunft mittels gelenkter Evolution für die industrielle Anwendung verbessert. Die Studie “Directed evolution of a highly active Yersinia mollaretii phytase” beschreibt die Klonierung, Charakterisierung und die direkte Evolution einer Phytase von Yersinia mollaretii Ymphytase. Die Ymphytase weißt mit einer spezifischen Aktivität von 1 073 U/mg eine zehnfach höhere spezifische Aktivität als herkömmlich verwendete pilzliche Phytasen auf. Zur Hochdurchsatzdurchmusterung der generierten Genbibliotheken auf ausschließlich Aktivität wurde eine Methode basierend auf Filterpapier und 384er Mikrotierplatten entwickelt. Noch aktive Varianten wurden auf erhöhte Thermostabilität und spezifische Aktivität mittels einer Kombination aus Absorption und Fluoreszenz basierenden Detektion-Systems im 96er Mikrotierplattenformat analysiert. Nach der Durchmusterung der mittels Sequenz-Sättigungs-Mutagenese SeSaM erstellten Mutantenbibliothek wurde eine Variante mit ∼20% erhöhter Thermostabilität von 58°C/20 min; verbleibende Aktivität Wild-Typ ∼34%; Variante ∼53%, und erhöhter Schmelztemperatur um 1.5°C bei einem geringen Verlust der spezifischen Aktivität identifiziert.

 
 

Dennig, A., Shivange, A. V., Marienhagen, J., and Schwaneberg, U. 2011. OmniChange: The Sequence Independent Method for Simultaneous Site-Saturation of Five Codons.

PLoS ONE, 6, 10: e26222. doi:10.1371/journal.pone.0026222

  OmniChange Urheberrecht: Bio VI OmniChange Methode

Methoden zur gezielten Erstellung von Mutantenbibliotheken wurden entwickelt, um vorwiegend „lokalisierbare“ Enzymeigenschaften wie Aktivität und Selektivität zu verbessern. Die derzeitigen Methoden der mehrfach ortsspezifischen Sättigungsmutagenese sind limitiert durch die Gensequenz, benötigen nachfolgende PCR-Schritte und/oder zusätzliche enzymatische Modifikationen. Wie berichten hier von einer Methode - OmniChange - welche die simultane und effiziente mehrfach ortsspezifische Sättigungsmutagenese von fünf unabhängigen Codons ermöglicht. Als Machbarkeitsnachweis wurden fünf chemisch gespaltene DNA-Fragmente, wovon jedes ein NNK-degeneriertes Codon enthielt, generiert und in einer Eintopfreaktion zur vollständigen Genlänge zusammengefügt, ohne dabei zusätzliche PCR-Amplifikationsschritte oder die Verwendung von Restriktionsendonukleasen oder Ligasen zu benötigen. Die Sequenzanalyse belegte das Vorhandensein von bis zu 27 andersartigen Codons an verschiedenen Positionen, was 84,4 % der theoretischen Vielfalt der NNK-Degeneration entspricht. OmniChange ist vollkommen sequenzunabhängig, benötigt keinen minimalen Abstand zwischen den mutierten Codons und kann innerhalb eines Tages durchgeführt werden.